表观遗传学研究中，组蛋白翻译后修饰、转录因子与DNA的相互作用，是解析植物基因表达调控机制的核心内容。CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation，靶向剪切及标签技术）作为一种新型表观遗传分析技术，以其样本量需求低、操作简便、分辨率高、信噪比高的优势，迅速应用于植物表观遗传学研究。

CUT&Tag技术的核心原理是通过特异性抗体识别靶标蛋白（组蛋白修饰或转录因子），借助Protein A/G与抗体Fc段的高亲和性，将Tn5转座酶靶向招募至靶蛋白结合的染色质区域；Tn5转座酶切割靶区域染色质，并同时将测序接头插入切割位点，最终通过PCR扩增构建文库，经高通量测序获得全基因组范围内靶蛋白的结合位点信息。

图 转座酶复合物结合染色体开放区域

图 cut tag实验流程和原理

一、CUT&Tag实验流程

（一）样本准备

样本质量直接决定实验成败，植物样本需遵循“新鲜、洁净、无污染”的原则。优先选取幼嫩叶片、根尖等分裂旺盛的组织，此类组织细胞核含量高、杂质少；种子、成熟根等特殊组织需适当增加样本量。常规步骤如下：

1. 先将新鲜植物组织用清水冲洗干净，吸干表面水分，在冰上切成小块；
2. 立即浸入液氮速冻30~60min，之后转移至-80℃冰箱保存，或直接用于后续实验。需注意，样本需避免反复冻融，有条件的话尽量多准备备份样本，应对实验失败风险。

（二）细胞核提取与磁珠结合

细胞核提取是植物CUT&Tag实验的关键步骤，需去除植物细胞壁、细胞质及多糖等杂质，获得完整、高活性的细胞核。操作步骤一般为：

1. 将冷冻样本用液氮研磨成细粉，转移至预冷的核分离缓冲液中，轻轻混匀后冰浴孵育，这步是进行组织裂解，将细胞核释放出来。

图 一边倒液氮一边研磨植物

2. 通过过筛和低速离心，弃掉上清，用核洗涤缓冲液重悬，达到杂质去除的目的。

3. 加入不同液相的试剂，让试剂分层，可以得到中间的细胞核层。

4. 吸取细胞核层进行离心，去除上清液，收集细胞核沉淀，用核洗涤缓冲液洗涤3次，去除残留杂质。

5. 质检，进行显微镜观察和细胞核计数，理想的细胞核形状圆滑，背景杂质少。

图 显微镜下的细胞核

6. 洗涤后的细胞核与活化好的伴刀豆球蛋白A磁珠（con A）结合，磁珠可与细胞核膜上的糖蛋白结合，便于后续实验操作，减少细胞核损失。

7. 结合后加入洋地黄皂苷透化细胞核膜，为抗体和转座体进入细胞核提供通道。

（三）抗体孵育

抗体孵育的特异性直接影响实验的信噪比，需选用ChIP级别的一抗，并搭配与一抗种属来源对应的二抗，常规步骤如下：

1. 将结合磁珠的细胞核重悬于抗体缓冲液中，加入特异性一抗，一般需要在4℃水平振荡孵育过夜（约12~16h），确保一抗与靶标蛋白充分结合。
2. 孵育结束后，用含洋地黄皂苷的洗涤缓冲液洗涤3次，去除未结合的一抗；加入二抗，室温振荡孵育1~2h，二抗和一抗结合，起放大信号的作用，孵育后再次洗涤，去除未结合的二抗。

（四）转座体结合与激活

将Protein A/G-Tn5转座体加入样本中，转座体通过Protein A/G与二抗的Fc段结合，被靶向招募至靶蛋白结合的染色质区域。孵育1h后，加入含镁离子的反应液，激活Tn5转座酶的切割活性；转座酶在靶区域切割染色质，同时将携带的测序接头插入切割位点，完成染色质的片段化和标签化。该步骤需严格控制孵育温度和时间，避免转座酶非特异性切割，导致背景信号升高。

（五）DNA提取与文库构建

转座体激活后，加入EDTA和SDS终止反应，若使用交联样本，需进行反向交联处理，新鲜样本可省略此步骤；加入DNA提取缓冲液，提取片段化的DNA，用DNA纯化试剂盒纯化，去除蛋白质、RNA等杂质（在DNA提取步骤之后，会加入内参，DNA Spike-inMix）。纯化后的DNA通过PCR扩增进行文库富集，PCR反应条件需根据引物类型和样本情况优化，扩增后进行文库质检，文库浓度需要满足上机测序的要求，且呈现“波浪形态”特征峰。文库质量合格后，进行定量和均一化处理，准备测序。

图 使用翌圣CUT&Tag试剂盒对 10w 数量的 293 细胞进行 H3K4me3 抗体的检测建库，

Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 检测文库片段长度分布如上图所示。

（六）高通量测序与数据分析

将合格的文库送至测序平台，采用MGI或illumina等高通量测序技术进行测序，获得原始测序数据，接着依据研究目的进行数据分析。

二、植物CUT&Tag实验关键注意事项

1. 样本处理：植物样本需尽量新鲜，避免反复冻融，防止细胞核破裂和蛋白降解。如果不得已必须冻存，推荐冻存在-80冰箱，尽快使用。
2. 抗体选择：必须选用ChIP级别一抗，确保抗体特异性；二抗需与一抗种属匹配，避免交叉反应；抗体用量需要参考抗体说明书。
3. 转座体控制：Tn5转座酶活性受温度、Mg²⁺浓度影响，需严格遵循实验条件；转座体孵育时间不宜过长，否则会导致非特异性切割，升高背景信号。

三、植物CUT&Tag实验的应用领域

（一）组蛋白修饰图谱解析

组蛋白修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化等）是植物表观遗传调控的重要方式，直接影响染色质状态和基因表达。CUT&Tag可高效检测全基因组范围内组蛋白修饰的分布特征，无需大量样本即可获得高分辨率的修饰图谱。研究表明，该技术可成功检测单子叶植物水稻、双子叶植物油菜、棉花等的组蛋白修饰，同时识别活性（H3K4me3）和抑制性（H3K9me2）组蛋白标记，为研究组蛋白修饰在植物生长发育中的调控机制提供了有力工具。

（二）转录因子结合位点鉴定

转录因子通过结合靶基因启动子区域的特定基序，调控基因表达，参与植物生长发育、逆境响应等过程。传统ChIP-seq技术检测转录因子结合位点时，背景信号高、分辨率低，而CUT&Tag技术可显著降低背景信号，提高检测分辨率，且样本需求量低，可用于稀有转录因子或低表达转录因子的结合位点鉴定。例如，在棉花中，利用CUT&Tag技术成功鉴定了H3K4me3修饰相关转录因子的结合位点，明确了其在棉花生长发育中的调控作用。

（三）植物逆境响应机制研究

植物在干旱、高温、盐碱等逆境条件下，会通过表观遗传调控调整基因表达，增强抗逆能力。CUT&Tag技术可快速检测逆境条件下，组蛋白修饰和转录因子结合位点的动态变化，解析逆境响应的表观遗传调控网络。例如，在水稻中，通过CUT&Tag技术检测干旱胁迫下组蛋白修饰的变化，发现H3K4me3修饰在抗逆基因启动子区域富集，参与水稻干旱响应的调控。

（四）作物品种改良

表观遗传调控与作物产量、品质、抗逆性等农艺性状密切相关。CUT&Tag技术可快速筛选与优良农艺性状相关的组蛋白修饰位点和转录因子结合位点，为作物分子标记辅助育种提供靶点。例如，通过解析作物抗逆相关的表观遗传标记，可培育抗逆性强、产量高的作物品种，推动农业生产发展。

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