rProtein G免疫沉淀磁珠是粒径为 200nm 的纳米磁珠表面上共价偶联了大量的 Protein G 蛋白，纳米级磁珠提供的超大比表面积，具有更多的结合位点，磁珠使用量更少，非特异性吸附率低。重组 Protein G 蛋白更适合于结合mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit and goat polyclonal Abs, 以及human IgG1, IgG2, IgG3 和 IgG4。本品适用的范围广泛，可应用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等样本的免疫沉淀（IP)和免疫共沉淀(COIP)。

 

产品性质

基质（Matrix spherical）	硅基磁珠
配体（Ligand）	重组Protein G
结合能力（Binding Capacity）	＞0.85 mg hIgG /mL磁珠
粒径 （Particle size）	200 nm
磁珠浓度（Concentration）	10 mg/mL
应用（Application）	IP、COIP、CHIP、RIP等

 

运输和保存方法

冰袋运输。2-8℃长期储存，有效期2年。

 

注意事项

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.本产品仅作科研用途！

 

使用方法

1. 缓冲液配制

平衡/结合/洗杂液:	0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
中和缓冲液：	1 M Tris-HCl，pH 8.5
洗脱缓冲液：	0.1 M 甘氨酸，pH 3.0
终止液：	50 mM Tris, pH 7.5

注：上述缓冲液为推荐的缓冲液配制，但IP实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到IP Lysis/Wash Buffer 的影响，因此可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验。

2. 抗原样品制备

本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。

血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 500g, 10 min），弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1×PBS洗涤2次；按每毫克细胞5-10 µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每 1.0×10⁵个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每 1.0×10⁵个细胞20-30 µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

大肠杆菌样品处理： 离心收集大肠杆菌（4℃, 12000g, 2 min）， 弃上清后称重， 按每克（湿重）菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5-10 mL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。

3.免疫复合物的制备：

注意：样品所需的量和孵育时间均依赖于每个特定的抗体-抗原体系，因而可能需要优化才能得到最大产量。

以下实验方案针对 2~10 μg 亲和纯化的抗体，根据需 要可以按比例放大。

1）在离心管中，将每个样品的细胞裂解液与 2~10 μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500 ~1500 μg。

2）用IP Lysis/Wash Buffer将抗体以及制备好的样品稀释至 300~500 μL。

3）在室温下孵育 1~2 h，或 4℃ 2~4 h，以形成免疫复合物。

4. 磁珠预处理：将磁珠漩涡振荡1 min，使其充分混悬；取25-50 µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。加入500 µL预冷结合缓冲液洗涤，进行磁性分离，吸弃上清，重复1次。加入200 µL结合缓冲液重悬磁珠备用。

5. 免疫沉淀 

1) 将抗原样品/抗体混合物加入装有磁珠的离心管中，保持混匀室温下孵育1~2 h，或4℃ 2~4 h。

2) 上述磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液，以备后续检测。

3) 向离心管中加入1 mL洗杂液，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁分离器上取下离心管，再重复洗涤两次。

6．抗原洗脱

A. 变性洗脱 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

1) 从磁分离器上取下离心管，向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀， 95℃加热5 min。

2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

B. 非变性洗脱

1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50 μL洗脱液，混合均匀，室温孵育5 min。

2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集洗脱液至新的 EP 管中。

3) 重复步骤 1）和2），收集洗脱液，与2）中洗脱液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

                                                                    HB230106