产品简介
rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“纳米表面生物技术”(S-TEC),将rProtein A/G高密度定向包被到粒径为200 nm的纳米磁珠表面,纳米级磁珠提供的超大比表面积,具有更多的结合位点、更高的抗体结合能力和极低的蛋白非特异性吸附率,一步纯化即可从血清样品中分离出纯度>90%的抗体,使用简便有效。
天然蛋白A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白G(Protein G)是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG,但在两者结合特异性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同时共价偶联了蛋白A和蛋白G,比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围,实用性更高。同时,本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品适用的范围广泛,可应用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等样本。
另外我司亦提供rProtein A/G IP/Co-IP Kit 蛋白A/G免疫(共)沉淀试剂盒(Cat#36421ES), 包含足够完成40个反应的试剂,每个反应使用25 uL磁珠,同时可进行10个阴性对照。
产品性质
基质(Matrix spherical) |
硅基磁珠 |
配体(Ligand) |
重组蛋白A/G |
结合能力(Binding Capacity) |
≥0.7 mg hIgG /mL磁珠 |
粒径(Particle size) |
200 nm |
磁珠浓度(Concentration) |
10 mg/mL |
应用(Application) |
IP、COIP、CHIP、RIP等 |
储存条件
2~8℃保存,有效期2年。
使用说明
工作液浓度应根据具体实验确定,建议进行预实验摸索最佳实验浓度。
【注】建议以下缓冲液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。
裂解缓冲液:0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液(Cat#20118ES)
平衡/结合/洗杂缓冲液:0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0
交联缓冲液:0.2 M 三乙醇胺,pH8.2
中和缓冲液:1 M Tris-HCl,pH 8.5
洗脱缓冲液:0.1 M甘氨酸,pH 3.0
交联剂:DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)
终止液:50 mM Tris-HCl,pH 7.5
本操作说明书提供以下四种样品处理方法,建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理,使待检测抗原释放至样品溶液中。
血清样品处理:若目标蛋白丰度较高, 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
悬浮细胞样品处理:离心收集细胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液(裂解液应在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM)。混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
贴壁细胞样品处理:移去培养基,用PBS清洗细胞两遍;用细胞刮棒刮脱细胞,收集至1.5mL EP管内,按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液(裂解液应在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM)。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
大肠杆菌样品处理: 离心收集大肠杆菌(4℃, 12000g, 2 min),弃上清后称重, 按每克(湿重)菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次;按每克(湿重)菌体5-10 mL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂,重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃, 17000g, 10 min)。
4. 抗体吸附
1) 加入目标抗体溶液(5-25 µg抗体总量),充分混匀,体积不足500 µL时用平衡液补足。
2) 室温孵育 10 min以上(具体时间根据结合效果调整),可以振荡或漩涡混合均匀。
3) 将EP 管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清液。如需要可留做进一步检测。
4) 加入500 μL 洗杂液混合均匀,置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清液。重复洗杂至少 3次。
5. 抗体交联 (备选)
1)如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略本步骤,直接进行操作6。 50μL-1mL 磁珠量均可以按照以下步骤操作,无需额外增加交联液体积。
2)加入 1 mL交联液,振荡悬浮,置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。该操作重复两次。
3)再加入1 mL含有20 mM DMP(dimetylpimelimidate dihydrochloride)的交联液, 此试剂需要现用现配。振荡悬浮,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管, 促使溶液和磁珠充分接触,约30 min后,置于磁分离器上,大约 1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。
4)使用1 mL终止液悬浮磁珠,终止交联反应,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,促使溶液和磁珠充分接触,约15 min后,置于磁分离器上,大约 1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。
5)加入1 mL平衡液,颠倒混匀,置于磁分离器上,大约 1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。再重复两次。
6. 抗原结合反应
1) 加入含有抗原的样品(通常100-1000 μL),用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。
2) 在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管 10 min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。
3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离,收集上清液,以备后续检测。
4) 向离心管中加入1 mL洗杂液,用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行磁性分离,弃上清液;从磁分离器上取下离心管,再重复洗涤两次。
7.抗原洗脱
A. 变性洗脱 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。
1) 从磁分离器上取下离心管,向其中加入80-100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀, 95℃加热 10 min。
2) 置于磁性分离器上,进行磁性分离,或者离心,收集上清液进行SDS-PAGE检测。
B. 非变性洗脱
1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入300 μL洗脱液,混合均匀,室温孵育10 min。
2) 置于磁性分离器上,进行磁性分离,收集洗脱液至新的 EP 管中。
3) 重复步骤 1)和2),收集洗脱液,与2)中洗脱液混合,加入中和液中和至 pH7.0-8.0。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20240730