rProtein A/G MagBeads (IP Grade) 蛋白A/G免疫磁珠

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产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品简介

 

rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“纳米表面生物技术”(S-TEC),将rProtein A/G高密度定向包被到粒径为200 nm的纳米磁珠表面,纳米级磁珠提供的超大比表面积,具有更多的结合位点、更高的抗体结合能力和极低的蛋白非特异性吸附率,一步纯化即可从血清样品中分离出纯度>90%的抗体,使用简便有效。

天然蛋白A(Protein A)是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白G(Protein G)是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG,但在两者结合特异性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同时共价偶联了蛋白A和蛋白G,比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围,实用性更高。同时,本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品适用的范围广泛,可应用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等样本。

另外我司亦提供rProtein A/G IP/Co-IP Kit 蛋白A/G免疫(共)沉淀试剂盒(Cat#36421ES), 包含足够完成40个反应的试剂,每个反应使用25 uL磁珠,同时可进行10个阴性对照。

 

产品性质

 

基质(Matrix  spherical

硅基磁珠

配体(Ligand)

重组蛋白A/G

结合能力(Binding Capacity

≥0.7 mhIgG /mL磁珠

径(Particle size)

200 nm

磁珠浓度Concentration

10 mg/mL

应用Application

IP、COIP、CHIP、RIP等

 

储存条件

 

2~8℃保存,有效期2年。

 

使用说明

 

工作液浓度应根据具体实验确定,建议进行预实验摸索最佳实验浓度。

  1. 缓冲液配制

【注】建议以下缓冲液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。

裂解缓冲液:0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4WB/IP裂解液(Cat#20118ES)

平衡/结合/洗杂缓冲液:0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0

交联缓冲液:0.2 M 三乙醇胺,pH8.2

中和缓冲液:1 M Tris-HCl,pH 8.5

洗脱缓冲液:0.1 M甘氨酸,pH 3.0

交联剂:DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)

终止液:50 mM Tris-HClpH 7.5

  1. 抗原样品制备

本操作说明书提供以下四种样品处理方法,建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理,使待检测抗原释放至样品溶液中。

血清样品处理:若目标蛋白丰度较高, 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理:离心收集细胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解液在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

贴壁细胞样品处理:移去培养基,用PBS清洗细胞遍;用细胞刮棒刮脱细胞,收集至1.5mL EP管内按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解液在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

大肠杆菌样品处理 离心收集大肠杆菌(4℃, 12000g, 2 min),弃上清后称重, 按每克(湿重)菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次;按每克(湿重)菌体5-10 mL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂,重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃, 17000g, 10 min)。

  1.  磁珠预处理
  1. 将磁珠漩涡振荡1 min,使其充分混悬;
  2. 50 µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中放置在磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸弃保护液。
  3. EP管从磁分离器上取下来,加入200 µL结合缓冲液洗涤,进行磁性分离,吸弃上清,重复2次。

4.  抗体吸附

1)  加入目标抗体溶液5-25 µg抗体总量),充分混匀,体积不足500 µL时用平衡液补足。

2)  室温孵育 10 min以上(具体时间根据结合效果调整),可以振荡或漩涡混合均匀。

3)  EP 管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清液。如需要可留做进一步检测。

4)  加入500 μL 洗杂液混合均匀,置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清液。重复洗杂至少 3次。 

5.  抗体交联 (备选)

1)如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略本步骤,直接进行操作6。 50μL-1mL 磁珠量均可以按照以下步骤操作,无需额外增加交联液体积。

2)加入 1 mL交联液,振荡悬浮,置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。该操作重复两次。

3)再加入1 mL含有20 mM DMP(dimetylpimelimidate dihydrochloride)的交联液, 此试剂需要现用现配。振荡悬浮,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管, 促使溶液和磁珠充分接触,约30 min后,置于磁分离器上,大约 1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。

4)使用1 mL终止液悬浮磁珠,终止交联反应,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,促使溶液和磁珠充分接触,约15 min后,置于磁分离器上,大约 1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。

5)加入1 mL平衡液,颠倒混匀,置于磁分离器上,大约 1 min,待溶液变澄清后,吸弃上清液。再重复两次。 

6.  抗原结合反应

1)  加入含有抗原的样品(通常100-1000 μL),用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。

2)  在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管 10 min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。

3)  上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离,收集上清液,以备后续检测。

4)  向离心管中加入1 mL洗杂液,用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行磁性分离,弃上清液;从磁分离器上取下离心管,再重复洗涤两次。

 7.抗原洗脱

A. 变性洗脱 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

1) 从磁分离器上取下离心管,向其中加入80-100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀, 95℃加热 10 min。

2) 置于磁性分离器上,进行磁性分离,或者离心,收集上清液进行SDS-PAGE检测。

B. 非变性洗脱

1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入300 μL洗脱液,混合均匀,室温孵育10 min。

2) 置于磁性分离器上,进行磁性分离,收集洗脱液至新的 EP 管中。

3) 重复步骤 1)和2),收集洗脱液,与2)中洗脱液混合,加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20240730

 

400-6111-883