产品简介

 

Anti-DYKDDDDK（Flag）IP/Co-IP kit (Flag标签蛋白免疫（共）沉淀试剂盒)是一种通过高质量的Anti-Flag免疫磁珠，进行Flag标签融合蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的试剂盒。本试剂盒包含高质量的Anti-Flag免疫磁珠及经过优化验证的免疫沉淀必要试剂，每个反应使用25 uL磁珠，本试剂盒所含试剂足够完成40个反应。

Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）是一种聚合物磁性微球，由高质量的鼠源抗DYKDDDDK (Flag) 单克隆抗体与粒径为200 nm的硅基磁珠通过共价偶联制备，本产品具有快速的磁响应性，超顺磁性、良好的分散性、粒径均一、极低的非特异结合和丰富的结合位点等特点，可用于带有Flag标签的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。

 

产品信息

 

类别	编号	组分名称	20765ES40（40T）	保存方式	翌圣货号
Part Ⅰ	20765-A	Lysis Buffer for IP Assays 免疫沉淀用(IP)裂解液	100 mL	-25~-15℃	20118ES
	20765-B	蛋白酶抑制剂Cocktail,EDTA-free,100×DMSO储液	1 mL	-25~-15℃	20124ES
	20765-C	5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液	1 mL	-25~-15℃	20315ES
Part Ⅱ	20765-D	Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads	1 mL	2~8℃	20565ES
	20765-E	1x TBS Buffer，TBS 缓冲液(粉末)，PH 7.4,1L	1 L	RT	60157ES
	20765-F	洗脱缓冲液	5 mL	2~8℃	N/A
	20765-G	中和缓冲液	1 mL	2~8℃	N/A

 

储存条件

 

Part Ⅰ-25~-15℃保存；Part Ⅱ2~8℃保存；有效期1年。

Part Ⅱ中的Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads，避免冷冻。

 

使用说明

 

工作液浓度应根据具体实验确定，建议进行预实验摸索最佳实验浓度。

1.缓冲液配制

裂解缓冲液：免疫沉淀用(IP)裂解液（20765-A）可解冻后直接使用。

平衡/结合/洗杂缓冲液：1x TBS Buffer，TBS 缓冲液(粉末)，PH 7.4,1L（20765-D）, 使用时用蒸馏水或超纯水溶解，定容至1L即可。

洗脱缓冲液：洗脱缓冲液（20765-F）可直接使用。

中和缓冲液：中和缓冲液（20765-G）可直接使用。

SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制：取适量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)（20765-C）用水稀释5倍即为SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。

2.样品制备

本操作说明书提供以下三种样品处理方法，建议您根据不同来源的样品选择适当的方式进行预处理，使待检测蛋白释放至样品溶液中。

血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL，置于冰上

备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂Cocktail，使蛋白酶抑制剂Cocktail的最终浓度为1×）。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

贴壁细胞样品处理：移去培养基，用PBS清洗细胞两遍；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂Cocktail，使蛋白酶抑制剂Cocktail的最终浓度为1×）。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

3. 磁珠预处理

3.1用移液器轻柔吹打Anti-Flag免疫磁珠，使其充分混悬，取25 µL 磁珠悬液置于1.5 mL离心管中。

3.2加入500 µL 裂解缓冲液/结合缓冲液并轻轻移液器混合，用移液器轻柔吹打重悬Anti-Flag免疫磁珠，放置在磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清。重复洗2次。

4.样品的结合

4.1在预处理后的磁珠中加入含有Flag标签的蛋白样品，置于翻转混合仪上孵育(常温1~2 h，或4℃过夜)；

4.2将上述混合液置于磁力架上静置，大约1 min，待溶液变澄清后，把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测Flag标签蛋白是否存在残留)，原离心管中剩余的即为蛋白-磁珠复合物；

注意：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果。

5.洗涤

5.1向上述步骤4.2所得的蛋白-磁珠复合物中加入1000 µL裂解缓冲液/洗杂缓冲液，轻柔混匀磁珠5~10 min，接着在磁力架上静置，大约1 min，待溶液变澄清后后, 吸弃上清；

5.2重复步骤5.1两次，直至洗涤后的上清液OD280小于0.05为止；

注意：如上清液的OD280仍大于0.05，则适当增加洗涤次数。

6.蛋白洗脱

A. 变性洗脱 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

1) 从磁分离器上取下离心管，向其中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀， 95℃加热 5min。

2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

B. 非变性洗脱

1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入100 μL洗脱液，混合均匀，室温孵育10 min。

2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集洗脱液至新的 EP 管中。

3) 重复步骤 1）和2），收集洗脱液，与2）中洗脱液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

 

注意事项

 

1.请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠，这些操作会导致磁珠聚集而降低结合能力。

2.本试剂盒提供的Lysis Buffer for IP Assays经反复测试，适合很多情况下的免疫沉淀或免疫共沉淀时的样品裂解和后续的洗涤。但 IP 实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到 Lysis/Wash Buffer 的影响，因此可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验。

3. 本产品仅作科研用途。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20241021