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Hieff Trans® siRNA/miRNA体外转染试剂是一种非脂质体PEI阳离子、两性分子转染试剂，为siRNA转染到哺乳动物细胞中而开发。适用于siRNA和miRNA的转染。这种转染试剂包裹siRNA或miRNA形成阳离子复合物，该复合物与细胞表面带负电的蛋白聚糖相互作用吸附在细胞表面，通过内吞进入细胞，形成内含体。该转染试剂具有质子海绵的作用，能够吸收溶酶体中的H+，质子的不断流入，导致复合体肿胀破裂，从而使外源siRNA或miRNA释放到细胞质中。
该产品可在广泛的细胞系中，实现siRNA超过90%的表达效率，避免了脱靶效应。适用于多种细胞转染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等贴壁细胞；以及难以转染的悬浮细胞系，如K562或THP-1细胞，可达到80%的沉默效率；同时还包括一些原代细胞，原代人成纤维细胞和原代人肝细胞等，可达到80%的沉默效率。
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品2-8 ℃保存，一年有效。不可冷冻！
注意事项
1）整个实验过程使用无RNA酶和无热原性的材料，如离心管、枪头、缓冲液。
2）转染前，确保siRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理过的，高纯度的siRNA或者miRNA有助于获得较高的转染效率。
3）PEI阳离子转染试剂应该在2-8 ℃保存，要注意避免多次反复长时间开盖，否则可能会导致PEI挥发，降低转染效率。
4）转染前一天，确保接种贴壁细胞密度在30%-50%左右，对于一些小细胞和生长缓慢的细胞，接种密度可适当扩大2倍。
5）转染前，确保siRNA/miRNA基因沉默表达不会影响细胞活力。
6）该产品只适合体外转染，不能用于体内转染。
7）本产品仅作科研用途！
操作流程
一．贴壁细胞转染（以24孔板和终浓度50 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表1）
接种贴壁细胞
1.为了提高转染效率，建议在转染前一天接种细胞，接种细胞密度建议30%-50%左右，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。
2.按照以下体系配制siRNA-PEI或miRNA-PEI核酸转染试剂阳离子复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释30 pmoles siRNA，混匀。
2）立刻向100 μL的siRNA中加入2-4 μL的转染试剂，旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30min
4）在形成复合物过程中，移除细胞生长培养基，每孔中加入500 μL新鲜预热的完全培养基。
5）直接将100 µL siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物加入细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。最终体积为600 µL ，siRNA终浓度为50 nM。
6）37 ℃，5% CO2培养箱培养，直至目的基因表达。建议一般siRNA表达水平通常在24-72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
图1 转染贴壁细胞操作流程
表1 siRNA终浓度为50 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值（贴壁细胞）
|
培养皿 |
每孔培养基体积 |
稀释用无血清培养基 |
siRNA物质的量(pmoles) |
转染试剂体积（µL） |
加入复合物后培养基总体积 |
|
96孔板 |
125 µL |
50 µL |
8.75 |
0.5-1.5 |
175 µL |
|
24孔板 |
500 µL |
100 µL |
30 |
2-4 |
600 µL |
|
12孔板 |
1 mL |
200 µL |
60 |
4-8 |
1.2 mL |
|
6孔板 |
2 mL |
200 µL |
110 |
8-16 |
2.2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
4 mL |
400 µL |
220 |
15-25 |
4.4 mL |
注：贴壁细胞培养密度与各细胞倍增时间有关，确保细胞转染时细胞密度在60-80%即可。
二．悬浮细胞转染（以24孔板和终浓度50 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表2）
接种细胞
1.为了优化悬浮细胞转染条件，与贴壁细胞相比，需要降低悬浮细胞培养基的体积。根据培养皿大小和完整培养基的体积，推荐接种悬浮细胞的数量如下表2所示。
表2 siRNA终浓度为50 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值（悬浮细胞）
|
培养皿 |
siRNA物质的量(pmoles) |
转染试剂体积（µL） |
转染当天接种细胞数 |
形成复合物培养基体积 |
转染前悬浮细胞的体积 |
转染4-6h后另加入培养基的体积 |
|
96孔板 |
5 |
0.5-1.5 |
1×104~ 2×104 |
50 µL |
50 µL |
100 µL |
|
24孔板 |
15 |
2-4 |
1×105 ~ 2×105 |
100 µL |
200 µL |
700 µL |
|
12孔板 |
35 |
4-8 |
2×105 ~ 4×105 |
200 µL |
500 µL |
1 mL |
|
6孔板 |
60 |
8-16 |
5×105 ~ 2×106 |
200 µL |
1 mL |
2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
120 |
15-25 |
2×106~ 5×106 |
400 µL |
2 mL |
4 mL |
2.按照以下体系配制siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释15 pmols siRNA，混匀。
2）向100 μL的siRNA中加入2-4 μL的转染试剂，立刻旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温孵育15 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30 min
4）在每孔200 μL细胞悬浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物，轻轻混匀。最终体积为300 µL，siRNA终浓度为50 nM。
5）37 ℃，5% CO2培养箱培养4-6 h后，再加入700 µL完全培养基，轻轻摇动培养板使其混匀。
6）继续放入培养箱中孵育，直至目的基因表达。建议一般siRNA表达水平通常在24-72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
【注】：为了优化内源性基因沉默，siRNA浓度需要做梯度摸索。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整。
- miRNA转染操作流程
该转染试剂也适合转染miRNA，转染贴壁细胞和悬浮细胞的具体操作请参考siRNA的操作流程。
HB240409
