产品简介

 

外泌体纯化柱试剂盒适用于澄清度高的非复杂生物样本（如细胞上清、牛奶澄清液等）中外泌体囊泡的分离和纯化。纯化柱采用尺寸排阻技术，根据颗粒的大小在颗粒通过装有多孔多糖树脂的柱子时对其进行分离。当样品在重力作用下通过纯化柱时，大颗粒首先流出，小颗粒则在下行过程中进入树脂孔，延迟流出。纯化柱体积由固体树脂（固定相）和液体缓冲液（流动相）占据。颗粒不与树脂发生化学结合，保证分离稳定性和可重复性。该试剂盒具有快速、高效、获得的外泌体纯度高等特点，可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

特别注明：本试剂盒仅为外泌体纯化试剂盒，非浓缩试剂盒，需购买外泌体提取试剂盒或采用其他方式对样本进行浓缩前处理。

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	41218ES05
41218-A	纯化柱	5 T
41218-B	适配器	5 T
41218-C	再生液	300 mL
41218-D	Exosome Purification Column	25 T

 

储存条件

 

室温运输，本试剂盒可于室温稳定保存12个月。

 

使用说明

 

1. 样品制备

单次上样体积：0.5 mL，上样前平衡至室温。

1）浓缩：建议使用细胞培养上清外泌体快速抽提试剂盒、乳液外泌体快速抽提试剂盒对样品进行100倍以上浓缩，或采用超离、切向流、100 kD超滤等方式，进行50倍以上浓缩。

注：谨慎使用超离，可能导致蛋白聚团影响分辨率。

2）推荐BCA浓度：含10%去外泌体血清的细胞上清粗提外泌体BCA浓度大于3 μg/μL，无血清细胞上清粗提外泌体BCA浓度大于1 μg/μL，乳液粗提外泌体BCA浓度大于3 μg/μL。

注：纯化柱的主要作用为去除蛋白和游离核酸等小颗粒物质，纯化过程会对样本进行一定的稀释，因此应尽量保证样品中有足够多的囊泡。如需拍摄电镜，原样颗粒数浓度建议大于8.0E+10 particles/mL。

2. 样品预处理

1）使用推荐方法浓缩样品。

2）过滤：使用0.22 μm滤膜去除粗提外泌体中的大颗粒。

注：经Exosome Purification Column（EP柱）纯化后的样品无需再使用0.22 μm滤膜过滤。

3）准备PBS：使用新过滤的PBS（0.22 μm）以避免污染和引入大颗粒，确保PBS的温度与柱子相同（18 - 25℃）。

注：尽量使用当天新配的经过0.22 μm滤膜过滤的PBS，或采购已过膜的PBS，避免引入微生物及颗粒物污染。如果使用4℃冰箱保存的PBS溶液，必须平衡到室温后再用，否则有可能在柱子中引入大量气泡，影响分离效果。

3. 柱平衡与清洗

1）实验前确保纯化柱处于18 - 25℃的操作温度范围内，在达到操作温度范围之前，请勿取下柱盖。

2）先取下顶盖上黑色橡胶帽，平衡气压后，再取下顶盖。

3）将纯化柱垂直安装到铁架台上，将废液收集管（离心管或者烧杯均可）放置于柱下方，以备使用。

4）弃去筛板上方的填料保存液（取下底盖，待填料保存液自然流尽或用移液器吸去）。

5）填料保存液流尽后，使用PBS对纯化柱的上室进行2 - 3次洗涤，随后加入20 mL PBS清洗柱内填料（可分次加，也可连接适配器，每毫升PBS流穿时间约1.5 - 2.5 min）。当所有PBS都进入柱内，液体将停止流出。

注：适配器的使用方式：绿色适配器上方连接20 mL规格注射器针筒。

6）PBS流尽后直接上样，或加入2 mL PBS盖上底盖备用。

注：若使用适配器，待针筒中PBS流尽，柱内剩余约2 - 3 mL缓冲液，可取下适配器，等待剩余PBS流尽，随即进行上样或加入2 mL PBS盖上底盖备用。

4. 外泌体搜集

1）上样前准备：使用推荐方法浓缩并过滤样本，准备若干标注好的1.5 mL EP管待用。

2）加入0.5 mL样品：一旦PBS不再流出，立即将室温平衡好的0.5 mL样品加至纯化柱筛板上（若样品不足0.5 mL，用PBS补足）。

注：避免在过程中长时间停止柱流，确保囊泡分离效果。

3）流穿2.87 mL缓冲液（空隙体积）：当所有样品都进入筛板，底部出口无液体流出后，加入2.37 mL PBS，等待PBS流过直至无液体流出。此过程中，共流出缓冲液体积2.87 mL（0.5 mL样品体积+2.37 mL缓冲液）

注：为准确确定流穿体积，仅加入固定体积溶液，等待其流过直至流动停止。

4）收集外泌体馏分：立即用新的EP管准备收集纯化体积，分次在筛板上方加入0.5 mL PBS，按0.5 mL/馏分收集2 - 3个馏分（纯度最佳为前2个馏分即1 mL体积，推荐合并前3个馏分即1.5 mL体积），每次等待体积流过直至流动停止。

5）过滤外泌体：将收集的外泌体馏分转入Exosome Purification Column（EP柱）上室中，于4℃以3,000×g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为过滤的外泌体（注：EP柱不可重复使用）。

6）测定收集产物的颗粒浓度和蛋白浓度。如需要，可使用100kD超滤管对收集产物进行进一步浓缩富集（选做）。

5. 柱再生和储存

1）柱再生：收集到所需体积后，用10 mL再生液进行清洗，再用20 mL PBS清洗，随后可进行第二次上样。

2）柱储存：如果要储存以备将来使用，先用10 mL再生液进行清洗，再依次用20 mL PBS、20 mL去离子水和20 mL的20%乙醇清洗，清洗结束后盖上底盖，倒入保存液（20%乙醇），盖上顶盖密封储存。

注：再生液为碱性，避免再生液清洗后直接添加去离子水或20%乙醇来平衡纯化柱，防止树脂床内的盐沉淀并损坏柱。

去离子水清洗可进一步洗去平衡过程中产生的盐，防止盐与20%乙醇直接接触产生结晶。

可按每毫升液体流穿需1.5 - 2.5 min估算各步骤清洗时间，避免柱内液体流尽后，填料干放时间过长。

 

注意事项

 

1. 当外泌体馏分用于后续高通量测序或者其他组学分析时，为避免交叉污染，建议使用新柱。
2. 再生过程中不可避免会产生盐，盐沉淀影响填料性能，每根柱子重复使用次数建议不超过5次。
3. 请注意使用过程中勿将柱子从高处摔落或摔打，以免导致柱床碎裂。
4. 再生液为碱性，有一定腐蚀性，请务必小心使用！
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 本产品仅作科研用途！

 

 

Ver.CN20241027