Q：荧光虫荧光素（ Firefly Luciferin）、甲虫荧光素（ Beetle Luciferin）和 D-Luciferin 有区别吗？

A：无区别。三者仅仅是不同公司在命名上的差异，均是化合物 (S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2

-thiazoline-4-carboxylic acid

Q：该系列产品主要用于哪些应用？

A：除用于活体成像外，荧光素类产品还用于荧光素酶参与的其他应用中，如 体外报告基因检测、微生物/病毒监测、焦磷酸测序等

Q：荧光素钠盐和 D-荧光素钠盐的区别？

A：荧光素钠盐：可用于细胞通透性检测，通过检测 OD490 处吸光度值测定 颜料的通透性。 D-荧光素钠盐：用于活体成像和报告基因系统，通过冷发光模块检测，不 需要激发光激发。

Q：荧光素钾盐、钠盐、自由酸区别？

A：三者的区别主要在于： 1）溶解性：盐形式易溶于水，其中钾盐溶解度为 60mg/ml，钠盐溶解度为 100mg/ml。自由酸不易溶于水，可用碳酸氢钠溶液弱碱调节溶解，其 在甲醇中的溶解度为10mg/ml，DMSO 中溶解度为 50mg/ml。 2）毒性方面：盐形式在使用过程中较方便，尤其是在体内成像实验中， 因其能够溶解在水中，反应毒性也会更小些（荧光素是一种由苯丙噻唑和 噻唑羧酸基团组成的低分子量有机化合物，有低毒性）。3）使用效果：无明显差异。在体内实验研究中，选用钾盐使用率较高。

Q：荧光素的纯度对实验有成影响吗？

A：有影响。99%以上的纯度较好。对于 99%纯度的荧光素，有 1%的固体杂质。若是这 1 g 的杂质溶 解在 25ml 的缓冲液中（该稀释比例是进行活体成像实验的标准稀释方法），此时杂质的浓度为 0.4 g/L。假 设杂质的分子量为 1000 g/mol,那么杂质的物质的量浓度为 400 μM，该浓度可能会抑制细胞内某些酶的作 用，并且有可能降低实验效果或对动物产生伤害。

Q：产品稳定性如何？

A：粉末避光保存于-20 或-70℃，有效期至少 1 年。

Q：活体成像底物作用原理？

A：D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物。其作用 机制是在 ATP 和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化发光。当 荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。2、天然腔肠素（Coelenterazine native）是海肾荧光素酶（Rluc）和 Gaussia 荧光素酶（Gluc）等多种荧光素酶的作用底物。

Q：推荐仪器？多功能酶标仪能用吗？

A：推荐仪器：1、具有生物化学发光检测模块。荧光素产生的光可以被光度计或闪烁计数器检测。常见的活体成像仪器：如 IVIS® Lumina 小动物活体成像系统，德国 Bruker 公司的 In-Vivo Xtreme 多模式小动物活体成像仪。2、多功能酶标仪：需要和仪器厂家确认是否具体生物化学发光检测模块（注： 不能用荧光显微镜。）

Q：荧光素是能进入细胞膜吗？

A：荧光素是小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障

Q：尾静脉注射和腹腔注射哪个好？

A：都可以的。腹腔注射扩散较慢，持续发光长；静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。

Q：100mg可以注射几只小鼠？

A：腹腔注射（i.p.），按照150 mg/kg的荧光素/体重浓度进行注射，20g的C57小鼠为例，每只小鼠检测一次的用量：150 mg/kg×20g=3mg，100mg÷3mg=33只。仅供参考，具体的用量以试剂为准，未加损耗情况。

Q：D-荧光素钾盐，对动物有毒副作用吗？

A：一般情况下，D-荧光素钾盐不会对动物产生毒副作用。

Q：荧光素钾盐，分解率是多少？

A：没有该信息。

Q: 荧光素氧化发光的过程需要镁离子和ATP，D-荧光素钾盐做体外成像的话，ATP和镁离子怎么满足呢？体外推荐用蒸馏水溶解钾盐。

A: 该产品体外成像，所需的ATP和镁离子，1.需要通过细胞培养基来实现。所以需要添加了ATP和镁离子的细胞培养基来稀释探针；2.细胞内本身也含有一定量的ATP和镁,可以促进反应。大部分情况下，细胞含有的ATP和镁是足够进行D-荧光素盐的反应的，但细胞种类不同，含量也不一样。可以先尝试培养基不加额外的ATP和镁，正常做一下，看看效果。

Q：底物的激发波长和发射波长？

A：化学发光，无需激发波长。萤火虫荧光素检测波长是 560nm。海肾荧光素 检测波长是 465 nm。

Q：底物可以进入活细胞中吗？

A：可以通过血脑屏障，胎盘屏障和血液测试屏障，也可以进入活细胞。

Q：荧光素类注射方式和用量？

A：下面建议浓度来源于文献：1）注射方式：可通过腹腔注射或尾静脉注射 2）注射量：科学的方法是根据动力学曲线评估注射剂量。建立最初尝试注射剂量 为：150mg 底物/kg 小鼠体重。因此，购买量可按照上述方法计算：若 10 只小鼠，22 -25g，则需要底物 33 -37.5mg 。

Q：荧光素的发光特性如何？

A：荧光素腹腔注射老鼠后约 3 min 后，能够表达荧光素酶的细胞开始发光，10 min 后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约 10 - 15 min 后开始衰减，可在注射后 10 -15 min 内检测。仅供参考，建议预实验建立荧光素酶 动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期

Q：活体成像实验，无效果的原因？

A：成功进行活体成像实验需要以下条件：目的组织或细胞表达荧光素酶基因；荧光素底物注射成功； 依赖于发光部位的组织厚度。若实验不成功，可从上述因素查找，荧光素酶基因是否表达，荧光素底物是否未正确注射，及发光部位较深等

Q：荧光素钾（钠）盐溶液如何配制？必须用不含钙离子和镁离子的 DPBS 溶解吗？

A：1、下面建议浓度来源于文献：

1）储备液（体外实验用） 浓度 100mM，约相当于 30mg/mL。用无菌蒸馏水溶解。 建议：现配现用，若无条件，可分装保存。 长期保存可能会导致信号衰 减。

2）1×工作液（体外实验用） 浓度 0.5mM，约相当于 150ug/mL。用预热的培养基稀释储存液至 1×。建议：现配现用，若多余，则舍弃。不建议再次使用。

3）15mg/mL 储存液（动物实验用）不含钙离子和镁离子的 DPBS 溶解（因为一方面，钙镁离子通常对胰酶活 性有影响；另外一方面在活体成像实验时，Mg2+是催化荧光素底物氧化的 重要因素，而Ca2+是和腔肠素底物氧化有关的离子），混匀。0.22μM 滤器 过滤除菌。 建议：现配现用，长期保存可能会导致信号衰减。

2. 除了 DPBS 外，还可以用其他缓冲液溶解荧光素底物，如生理盐水 Nacl 等。原则上避免溶液中的阳离子对实验造成影响。可参考相关文献操作。

Q: 为什么双荧光素酶报告基因实验需要裂解细胞，但是用荧光素钾盐和钠盐进行细胞实验不需要裂解细胞？

A: 1、荧光素酶是表达在细胞内，是一种不存在于人类物种的水解酶（所以本底很低），它不能透膜。荧光素酶的底物是环状小分子，是疏水的，因而可以透膜的，因此只要存在荧光素酶表达，那必然是外源的，那么将底物加到细胞培养基中或打到体内均能得到信号。

2、报告基因体外检测需要细胞裂解是为了避免细胞转染异质性、底物渗透不均匀和信号不均一而强行匀质化的做法。体外报告基因检测是一个定量且灵敏度很高的实验，报告基因检测需要ATP和氧气的存在，裂解细胞是需要把表达的荧光素酶完全释放出来，能够有更好的反应，因为细胞内的氧气含量有限，如果不裂解，会导致信号一定程度的降低（有的裂解液也做了一些优化，比如额外加了ATP以提高信号等）。因此报告基因体外检测裂解细胞能够有更好的信号；

3、活体成像，检测仪器功率大，能够透过皮肤，细胞，有更强的穿透力，因此可以不用裂解细胞就可以检测到很强的荧光信号，另外活体成像检测相对比较粗糙。

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