— — 生物化学发光检测法（荧光素酶）
背 景
活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。这项技术已被广泛应用于多个领域，常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。
原 理
常见的荧光素酶有两种，分别是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，编码基因是luc）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，编码基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它们共同的作用原理是在ATP和荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光（不同底物光的颜色和波长不同），当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。
D-Luciferin（D荧光素）
D-Luciferin：有三种，分别是D-Luciferin, Sodium Salt/D荧光素钠盐、D-Luciferin, Potassium Salt/D-荧光素钾盐和D-Luciferin Firefly,free acid/D-萤火虫荧光素YEASEN公司提供几种常用类型的D-Luciferin，每批试剂都经过严格的质量验证（经9次独立的HPLC和FTIR标准法监测）和发光效率检测，确保客户每次试验的高重复性和成功性。所有产品都可用于体内成像分析和体外化学发光检测实验。YEASEN的D-Luciferin是合成的萤火虫荧光素，结构与promega公司提供的甲虫荧光素一致，是水溶性的萤火虫荧光素酶底物。
（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D荧光素钠盐
分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 纯度：高级纯（99.7%）
应 用：1）体外化学发光分析（in vitro）；2）活体成像实验（in vivo）；3）高灵敏度ATP分析；
步 骤：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 体外生物发光检测
1）用33.3 mL蒸馏水溶解1.0 gD-荧光素钠盐，配制成100 mM的储存液（200×，浓度30mg/ml）。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。
2）用组织培养基1∶200稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)。
3）去除培养细胞的培养基。
4）待图像分析前，向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活体成像分析
1）用无菌的PBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钠盐工作液(15mg/mL)，0.2um滤膜过滤除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）注射量取决于注射方式，具体如下：
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注射方式 |
剂量 |
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静脉注射（25-27 gauge针头） |
按10 uL/g体重浓度，加入相应体积的15 mg/mL荧光素工作液 |
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腹腔注射（25-27 gauge针头） |
按10 uL/g体重浓度，加入相应体积的15 mg/mL荧光素工作液 |
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肌肉注射（27 gauge针头） |
50 uL，浓度为1–2 mg/mL荧光素工作液 |
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鼻内注射（pipette） |
50 uL，浓度为3 mg/mL荧光素工作液 |
3）注射入体内5-10分钟后，进行成像分析。
（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-荧光素钾盐
分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 纯度：高级纯（99.7%）
应用：
1）活细胞、组织或生物体内luc标记基因和荧光素酶-融合基因体内/体外表达的成像分析；
2）广泛用于报告基因分析，免疫分析和ATP荧光卫生监测分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 体外生物发光检测
1）配制成100 mM的储存液（200×，浓度30mg/ml）。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。
2）用预热好的组织培养基1∶200稀释储存液，配制工作液(终浓度150μg/mL)。
3）去除培养细胞的培养基直至无残留。
4）图像分析前立即向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析（或者细胞放在37℃短时间孵育后检测可增强信号）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活体成像分析
1）用无菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钾盐溶液(15mg/mL)，0.2um滤膜过滤除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g体重的浓度向每支小鼠注射相应量的15mg/mL荧光素溶液；
3）腹腔注射10-15 min后进行成像分析。（对每只动物模型做荧光素动力学研究以确定峰值信号获取时间）
（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-萤火虫荧光素
分子式：C11H8N2O3S2 分子量：280.330 g/mol 外观：白色至浅黄色粉末
溶解：0.25%浓度溶解于甲醇，形成近乎无色至浅黄色的清夜
保存：-15°C 避光
应用：
1）活细胞、组织或生物体内luc标记基因和荧光素酶-融合基因体内/体外表达的成像分析；
2）广泛用于报告基因分析，免疫分析和ATP荧光卫生监测分析；
应用实例：
活体成像检测CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T细胞对小鼠皮下注射HN4细胞成瘤的治疗作用（Mei Z et al. Cancer Med. 2020 ）
使用荧光素（Luciferin）发表的文献:
[1] Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice. Stem Cell Res Ther. 2020 Sep 16;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.
[2] Tang Y, Lin S, Yin S, Jiang F, Zhou M, Yang G, Sun N, Zhang W, Jiang X. In situ gas foaming based on magnesium particle degradation: A novel approach to fabricate injectable macroporous hydrogels. Biomaterials. 2020 Feb;232:119727. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119727. Epub 2019 Dec 24. PMID: 31918223.
[3] Xuan Z, Zhao L, Li Z, Song W, Chen J, Chen J, Chen H, Song G, Jin C, Zhou M, Xie H, Zheng S, Song P. EPS8L3 promotes hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis by modulating EGFR dimerization and internalization. Am J Cancer Res. 2020 Jan 1;10(1):60-77. PMID: 32064153; PMCID: PMC7017737.
[4] Zhou Y , Zhou C , Zou Y , Jin Y , Han S , Liu Q , Hu X , Wang L , Ma Y , Liu Y . Multi pH-sensitive polymer-drug conjugate mixed micelles for efficient co-delivery of doxorubicin and curcumin to synergistically suppress tumor metastasis. Biomater Sci. 2020 Sep 21;8(18):5029-5046. doi: 10.1039/d0bm00840k. Epub 2020 Aug 19. PMID: 32812957.
[5] Ni XR, Zhao YY, Cai HP, Yu ZH, Wang J, Chen FR, Yu YJ, Feng GK, Chen ZP. Transferrin receptor 1 targeted optical imaging for identifying glioma margin in mouse models. J Neurooncol. 2020 Jun;148(2):245-258. doi: 10.1007/s11060-020-03527-3. Epub 2020 May 13. PMID: 32405996.
[6] Wu D, Lv J, Zhao R, Wu Z, Zheng D, Shi J, Lin S, Wang S, Wu Q, Long Y, Li P, Yao Y. PSCA is a target of chimeric antigen receptor T cells in gastric cancer. Biomark Res. 2020 Jan 28;8:3. doi: 10.1186/s40364-020-0183-x. PMID: 32010446; PMCID: PMC6988264.
[7] Mei Z, Zhang K, Lam AK, Huang J, Qiu F, Qiao B, Zhang Y. MUC1 as a target for CAR-T therapy in head and neck squamous cell carinoma. Cancer Med. 2020 Jan;9(2):640-652. doi: 10.1002/cam4.2733. Epub 2019 Dec 4. PMID: 31800160; PMCID: PMC6970025.
[8] Hu H, Zhang Z, Wang R, Wang Y, Jin J, Cai L, Yang J, Duan H, Wu Z, Fang Z, Liu B. BGC823 Cell Line with the Stable Expression of iRFP720 Retains Its Primary Properties with Promising Fluorescence Imaging Ability. DNA Cell Biol. 2020 May;39(5):900-908. doi: 10.1089/dna.2019.5057. Epub 2020 Feb 25. PMID: 32096664.
[9] Qiu J , Peng P , Xin M , Wen Z , Chen Z , Lin S , Kuang M , Fu Y , Fang G , Li S , Li C , Mao J , Qin L , Ding Y . ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020 Jun 7;8(11):3147-3163. doi: 10.1039/d0bm00147c. Epub 2020 May 4. PMID: 32363359.
[10] Zhao XY, Jiang Q, Jiang H, Hu LJ, Zhao T, Yu XX, Huang XJ. Expanded clinical-grade membrane-bound IL-21/4-1BBL NK cell products exhibit activity against acute myeloid leukemia in vivo. Eur J Immunol. 2020 Sep;50(9):1374-1385. doi: 10.1002/eji.201948375. Epub 2020 Jun 3. PMID: 32357256.
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