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干货|单细胞全基因组扩增技术与胚胎植入前遗传学诊断

人类辅助生殖技术快速发展，帮助不育患者实现生育的愿望，同时胚胎植入前遗传学诊断有效降低了后代患遗传病的风险。从培养的胚胎中取出个别卵裂球细胞、极体或滋养层细胞进行遗传学检测，结合高通量测序技术，通过分析选择正常的胚胎移植，但单个细胞的基因组DNA含量通常在pg级别，无法满足各大测序平台的要求，单细胞全基因组扩增技术（whole genome amplification，WGA）成为了首要解决超低量样本的方式之一。

该技术可在单细胞的水平上对全基因组进行非选择性扩增，尽可能减少扩增偏好性，获得准确的、均一性良好的、高覆盖度的扩增基因组序列。目前已有多种单细胞全基因组扩增技术，下面就和小翌一起看看这些技术吧！

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图1.常用WGA技术


基于热循环PCR的技术


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PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）


技术原理：使用~15bp的完全随机引物在37℃的低退火温度下进行退火，然后逐渐将温度升至55℃进行引物延伸，退火和引物延伸的时间都相对较长。

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DOP-PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR）


技术原理：使用部分简并引物随机结合在单细胞基因组上，使用多个退火温度和延伸温度进行PCR反应随机扩增全基因组序列。

两者区别在于PEP-PCR使用的引物为完全随机寡核苷酸引物，而DOP-PCR的引物为简并寡核苷酸引物，为部分随机引物，同时DOP-PCR的退火温度的设计也有所不同，DOP-PCR有多个退火温度与延伸温度，在最初几个循环中的退火温度较低（~25℃），确保引物尽可能的结合到基因组模板上，而之后的循环中则采用相对更高的退火温度（~55℃）继而进行PCR反应。与PEP-PCR相比，DOP-PCR在引物和PCR参数的设计上进行了严格的优化升级，一定程度上提升了扩增的准确度和基因组覆盖度，但仍然有较高的错误率。

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LM-PCR（ligation-mediated PCR）


技术原理：使用限制性内切酶在基因组相应位置上随机切断单细胞基因组 DNA，然后在末端引入扩增引物，再通过PCR反应进行全基因组扩增。该方法扩增效率高，但步骤较多，且对于高GC等复杂结构区域的序列容易出现扩增偏差。

总之，以热循环PCR为基础的扩增技术，均会引入一些错误，主要取决于聚合酶的保真性，另外由于引物或限制性内切酶以及碱基扩增的偏好性会使得全基因组扩增产物覆盖度不足。此类技术可应用于SNP/STR分型；1M bin size水平上的检测，DOP-PCR也可用于对染色体的CNV进行定量。不太适用于检测基因突变，假阳性率较高。

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图2.基于热循环PCR的WGA技术


基于等温扩增的技术


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多重置换扩增技术MDA（multiple displacement amplification）


技术原理：使用随机的六聚体引物和phi29DNA聚合酶进行反应，在恒温条件下进行扩增。该聚合酶具有很强的链置换特性，可扩增产生50~200kb的DNA片段，可用于构建大片段文库，同时该酶还能以新合成的DNA子链为模板，继续合成新的DNA子链，扩增产量高，同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，phi29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性，准确性更高、基因组覆盖度更高，适用于SNV分析，但仍具有一定的基因组区域偏好性，这种偏好性是随机的难以重复，因此对CNV分析有一定影响。另外MDA扩增对样本的完整性要求较高，对不完整的DNA扩增效率较低，因此MDA不太适用于固定后的样本。

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图3.MDA 全基因组扩增技术



多次退火环状循环扩增技术MALBAC


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MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）


技术原理：该技术将 PCR 和 MDA 技术联合，同时兼顾了单细胞基因组扩增的保真度和均一性。亮点在于扩增引物的5’含有27bp的共同序列，3’含有8bp的随机序列，该引物在低温下与模板结合，先经过几个循环的多重链置换反应后，形成完整的扩增产物两端会引入互补的序列，使得新扩增的DNA分子形成一个loop结构而无法被作为模板进行扩增，而原始的基因组DNA链和Semiampilicon则可继续作为模板链进行扩增，一定程度上减小了指数扩增带来的偏好性。

MALBAC第一轮扩增利用多重置换反应提高扩增产物的全基因组覆盖度，并在一定程度上保证了扩增产物的准确定，再结合PCR技术进一步扩增，提升产物的准确率的同时保证均一性，但在模板拷贝数极低时易扩增偏差，可能出现非特异性扩增，有一定的错误率，但是这种错误在不同的细胞中是可重复的，因此可以通过后期识别这种错误，避免假性结果。

总的来说，MALBAC技术兼具高保真性和高基因组覆盖度，可用于SNV检测和CNV检测，可以同时用于新鲜样本和固定后样本的全基因组扩增。目前也是辅助生殖中广泛采用的技术之一。

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图4.MALBAC WGA技术

胚胎植入前用来做 PGD 的样本通常为极体或囊胚期单细胞，能够用于检测的 DNA 含量很少，并且能够检测的靶点比较少。单细胞基因组高通量测序技术的发展大大提高了PGD 检测成功率，全基因组扩增技术基本解决了单细胞基因组扩增的问题，尽管也有很多不足，但技术的不断更新和改善，减少了诸如扩增偏好性、扩增假象、覆盖度不足、错误率等问题，使其越来越满足临床检测需求。

翌圣近期将推出单细胞全基因组扩增试剂盒，提供单细胞全基因组扩增方案，助力辅助生殖领域，敬请期待！


参考文献


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