产品简介

 

YeaCell^TM单细胞纯化试剂盒包括单细胞乳浊液纯化试剂、cDNA纯化磁珠以及DNA纯化分选磁珠。本试剂盒中的磁珠在回收核酸方面可实现更高的灵敏度和更好的性能，获得的核酸产量高，稳定性强，均一性好。

 

组分信息

 

组分编号		组分名称	12521ES02	12521ES08	12521ES16	12521ES96
BOX-I	12521-A	Dynabeads MyOne SILANE	16 μL	64 μL	128 μL	768 μL
	12521-B	Cleanup Buffer	375 μL	2×750 μL	4×750 μL	18 mL
	12521-C	cDNA Clean Beads	120 μL	480 μL	960 μL	5.76 mL
	12521-D	DNA Clean Beads	400 μL	2×800 μL	4×800 μL	19.2 mL
BOX-II	12521-E	Reducing Agent	100 μL	400 μL	800 μL	3×960 μL

 

储存条件

 

Box I:2~8℃保存,Box II-25℃~ -15℃保存。有效期1年。

 

使用说明

 

注意事项

1.关于操作

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）请于使用前将试剂盒各组分置于室温平衡。使用前上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于室温备用。

3）产品组分使用完后，请尽快放置于4℃条件下进行保存。

4）请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5）PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6）本产品仅作科研用途！

2.磁珠纯化与分选

1）建库过程中有多个步骤需要使用纯化磁珠进行纯化和分选。

2）磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3）磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4）转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5）磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6）产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

3.cDNA质控&文库质控

1）通常情况下，构建好的全长cDNA&文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2）文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3）文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。

4）文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

4.自备材料 (Other Material)

1. 胶珠：翌圣Cat#12526或其他等效产品。
2. Oil、破油试剂：YeaCell^TM Recovery Agent (Cat#12525)或10×Genomics芯片上带的试剂及其他等效产品。
3. 芯片：10×Genomics，Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit及其他等效芯片。
4. Index：翌圣，YeaCell^TM UDI Primer kit for Illumina® (Cat#12522)及其他等效产品。
5. 仪器：10×Genomics，Chromium Controller及其他等效微流控设备。
6. 扩增产物质检：Agilent Bioanalyzer 2100、Qsep100（Bioptic）。
7. Qubit定量试剂及仪器：1×dsDNA HS Assay Kit (Yeasen Cat#12642)及其他等效产品。
8. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水； 200 μL低吸附PCR管、200 μL低吸附枪头、磁力架。

 

使用方法

 

1.乳浊液破油纯化

以YeaCell^TMSingle Cell 3ʹ RNA-seq Kit（Yeasen Cat#12520）为例，获得的油包水乳浊液（GEM）逆转录后需进行下述操作。

1）加入125 μL Recovery Agent（Yeasen Cat#12525或其他等效产品）到样品孔中，不要吹打或者震荡，静置5min后吸弃125 μL下层油相。

注：Recovery Agent与Reducing Agent名称相近，但是用处相差较大，需要注意不能弄混淆。

2)参照表1准备Dynabeads Cleanup Mix（提前将Dynabeads MyOne SILANE磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min，配制80%乙醇）。

表1 Dynabeads Cleanup Mix配制

名称	体积 (μL)
Cleanup Buffer	182
Dynabeads MyOne SILANE	8
Reducing Agent	5
Nuclease-free Water	5
Total	200

3）Dynabeads Cleanup Mix涡旋混匀后加入到上述GEM样品中，枪头吹打10次。

4）室温孵育10min，间隔5min用枪头吹打混匀。

5）参照表2准备Elution Solution I，涡旋混匀后瞬时离心。

 

表2 Elution Solution I配制

名称	体积 (μL)
Buffer EB	49
10% Tween20	0.5
Reducing Agent	0.5
Total	50

6）孵育10min结束后，置于磁力架上，待液体完全澄清后吸弃上清。

7）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

8）重复步骤7一次。

9）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠（1 min）。

10）将PCR管从磁力架中取出，加入35.5 μL Elution Solution I，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀。

11）室温静置5 min后，将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取35 μL上清至新PCR管中。

12）衔接YeaCell^TM Single Cell 3ʹ RNA-seq Kit(Yeasen Cat#12520或其他等效产品)cDNA扩增步骤。

2.cDNA纯化

以YeaCell^TM Single Cell 3ʹ RNA-seq Kit（Yeasen Cat#12520）为例，cDNA扩增结束后，使用cDNA Clean Beads纯化回收cDNA。

1）准备工作：将cDNA Clean Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）涡旋振荡或上下颠倒磁珠以保证充分混匀。

3）吸取60 μL cDNA Clean Beads（0.6×，Beads:cDNA=0.6:1）至cDNA产物中，吹打混匀，室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重复步骤5）一次。

7）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（1 min）。

8）将PCR管从磁力架中取出，加入40.5 μL Buffer EB，轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取40 μL上清至新PCR管中。

9）使用Qubit对文库进行定量。4℃保存72 hour，－20℃保存一周或者立即进行下一步文库构建。

3.DNA 纯化

参照YeaCell^TM Single Cell 3ʹ RNA-seq Kit（Yeasen Cat#12520）说明书，使用DNA Clean Beads对构建好的文库进行纯化或分选操作。

4. cDNA&文库质控

1）cDNA纯化后获得的产物，可通过Agilent Bioanalyzer 2100的High Sensitivity DNA Chip检测cDNA扩增产物。

2）构建好的文库纯化或者分选后获得的产物，可以通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价。

 

 

 

Ver.CN20250207