HEK-293 Cas9 Cell Line 是一种由慢病毒构建的表达SpCas9内切酶NLS的稳转株细胞，细胞含有杀稻瘟菌素（Blasticidin）抗性。HEK-293 Cas9 Cell Line可以用靶向目标基因的sgRNA进行转染，以快速产生敲除细胞系。与目的基因sgRNA结合后，可以有效地用于目标基因组修饰，包括基因敲除、基因敲入、基因诱变、基因标记等，是理想的sgRNA细胞筛选和验证模型。靶向目标基因的sgRNA质粒或慢病毒均可由吉满生物构建。

本细胞系是将SpCas9内切酶NLS慢病毒感染HEK-293细胞并筛选得到的稳定株。

培养条件

使用方法

1. 细胞复苏

a) 37 ℃水浴锅预热复苏培养基，加入预热后的复苏培养基 5 mL 至 15 mL 离心管。

b) 从液氮中取出冻存细胞并迅速放入 37 ℃恒温水浴锅，将细胞液面浸至水面以下轻轻摇动解冻，直到刚刚融化（通常 2-3 分钟）。

c) 用 70% 乙醇擦拭冻存管外部以降低污染的几率。在生物安全柜或超净台中将冻存管中的细胞悬液转移到步骤 a) 的离心管中，轻轻混匀，176 × g，离心 3 min，使细胞沉淀，弃上清。

d) 使用 1 mL 复苏培养基重悬，可取出部分使用台盼蓝染色计数活细胞，活细胞 ≥ 3 × 10⁶ cells/mL。

e) 通过补加复苏培养基的形式，调整活细胞密度到 2-3 × 10⁵ cells/mL，根据细胞悬液总体积，将细胞接种到合适的培养皿中。

【注】细胞复苏后的 1 至 2 代，使用复苏培养基，待细胞状态稳定后，再更换为含有抗生素的生长培养基。

2. 细胞传代

a) 细胞为上皮细胞，贴壁生长。培养箱中孵育 16-24 h 后，镜下观察细胞贴壁情况，当细胞密度大于 80%，即可进行细胞传代。推荐细胞传代比例为 1:3-1:4，2-3 天传代。

b) 将皿或培养瓶中的培养液弃去，10 cm 皿加 2 mL PBS 润洗 1 次。

c) 弃 PBS，加 1 mL 0.25% Trypsin-EDTA 消化液，37 ℃ 消化 30-60 s，显微镜下观察。

d) 待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁时，加 2 mL 左右生长培养基混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，176 × g 室温离心 3 min。

e) 弃上清，细胞沉淀用生长培养基重悬，根据传代前细胞密度分盘（根据培养皿面积和细胞密度计算，传代后细胞密度为 30-40%）。

【注】推荐细胞传代比例为 1:3-1:4，2-3 天传代；贴壁细胞汇合度不可大于 80%。

3. 细胞冻存

a) 使用 176 × g，3 min 离心收集细胞。

b) 使用预冷细胞冻存液（90% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，细胞密度调整为 5 × 10⁶ cells/mL，每管 1 mL 分装到细胞冻存管中。c) 拧紧盖子，适当标记后，将冻存管置于梯度降温盒中，-80 ℃ 下保存至少 1 天，尽快转移至液氮中。

验证结果

细胞系产品干冰运输，–196 ℃ 以下（液氮气相）长期储存。收到产品后请立即确认产品是否为冻存状态，–196 ℃ 以下（液氮气相）长期储存。