非特异扩增是PCR实验中的常见问题，非特异扩增直接影响检测结果的判读并且会导致扩增灵敏度下降，甚至目标片段的得率下降等。此外，检测试剂的稳定性也是核酸检测行业人格外关注的问题，不管是长期储存稳定性还是短期偏离正常保存条件的稳定性，都直接影响检测结果的有效性。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下简称“翌圣生物”）匠心开发出热启动Taq酶双封闭抗体，通过同时封闭Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性来有效提高扩增的特异性及试剂的稳定性。

PART 01

Taq酶双封闭抗体封闭原理

传统的Taq DNA聚合酶抗体可以有效抑制Taq酶的聚合酶活性，从而避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。然而Taq酶除了具有5'→3'聚合酶活性，还有5'→3'核酸外切酶活性，这部分外切酶活性可能会在低温时导致错配探针或其它物料降解，造成非特异信号。翌圣生物开发的热启动Taq酶双封闭抗体不仅可以封闭Taq酶的有5'→3'聚合酶活性，还能同时封闭Taq酶的5'→3'外切酶活性，双管齐下，既能有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，又能防止物料降解产生非特异信号，双重提升试剂的稳定性。

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图1. 翌圣双封闭抗体封闭原理示意图

图中高亮部分为Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性结构域和5'→3'核酸外切酶活性结构域，翌圣双封闭抗体含两种抗体，可同时封闭Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

PART 02

Taq酶双封闭抗体使用方案

翌圣生物Taq酶双封闭抗体不仅可封闭野生型Taq酶，对于多种突变体Taq酶亦可适用，封闭之后的热启动Taq酶可以正常保存至-20℃。

1 µL抗体（5 mg/mL）可封闭20-50 U Taq DNA聚合酶：

• 小样室温（25℃）旋转混匀孵育30 min

• 大样室温（25℃）旋转混匀孵育2~3 h

PART 03

Taq酶双封闭抗体性能展示

1 双封闭抗体有效封闭Taq DNA聚合酶外切酶活性

将合成的引物探针分别配于未封闭以及双封闭抗体封闭的Taq DNA聚合酶的反应液中，40℃反应，检测两者荧光信号。

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图2. 双封闭抗体外切酶活性封闭效率检测

黄色：未封闭的Taq DNA聚合酶组；紫色：双封闭抗体封闭的Taq DNA聚合酶组

由图2可以看出双封闭抗体可有效封闭Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

2 使用双封闭抗体分型准确，灵敏度更高

分别用翌圣生物双封闭抗体以及T公司抗体对Taq酶封闭后通过ARMS-PCR技术检测阳性样本。

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图3. ARMS-PCR扩增曲线图

蓝色：T公司封闭抗体封闭；红色：翌圣双封闭抗体封闭

由图3可以看到翌圣生物双封闭抗体封闭的Taq酶在ARMS-PCR扩增中分型准确，灵敏度更高。

3 双封闭抗体有效提升检测试剂稳定性

用传统封闭抗体与双封闭抗体分别封闭Taq DNA聚合酶，配置成含引物探针的全预混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，扩增10000拷贝ASFV质粒，观察扩增曲线和Ct值变化，对比传统封闭抗体和双封闭抗体对全预混反应液稳定性的作用。

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图4. 传统封闭抗体(A)、双封闭抗体(B)封闭反应液扩增10000拷贝ASFV质粒扩增曲线图

蓝色：4℃放置10天；红色：4℃放置0天（对照）

由图4可以看出，双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定，有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液4℃放置10天扩增曲线和Ct值无明显变化。

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图5. 传统封闭抗体(A)、双封闭抗体(B)封闭反应液扩增10000拷贝ASFV质粒扩增曲线图

蓝色：37℃放置5天；绿色：37℃放置3天；黄色：37℃放置1天；红色：37℃放置0天（对照）

由图5可以看出，双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定，有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液37℃放置1、3、5天Ct值差小于0.2。

4 双封闭抗体帮助解决基线上漂问题

某些引物配合特定buffer和仪器时，会出现基线上漂的情况。翌圣生物尝试多种方法改善基线问题，发现双封闭抗体更有利于基线平稳。

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图6. N基因(A)、ACT基因(B)扩增曲线图

红色：传统封闭抗体封闭；绿色：双封闭抗体封闭

由图6可以看出特定引物和buffer下，使用双封闭抗体可帮助解决基线上漂问题。

5 使用双封闭抗体获得良好线性

用双封闭抗体封闭的反应液扩增100000、10000、1000、100拷贝ASFV/ACT双质粒，制作标准曲线。

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图7. 双封闭反应液制作ASFV基因(A)、ACT基因(B)标准曲线图

由图7可以看到，ASFV基因标准曲线R²为0.998，扩增效率为98.848%；ACT基因标准曲线R²为0.998，扩增效率为98.113%，两者线性均良好，且均无非特异性扩增。

6 双封闭抗体可快速释放酶活

分别用进口T公司抗体和翌圣生物双封闭抗体封闭Taq酶，并在95℃下热激20 s，检测酶活。可以看到95℃热激 20 s后，翌圣生物双封闭抗体可释放95%以上的酶活，与T公司抗体相当。

	原酶	翌圣生物双封闭抗体（95℃，20 s）	T公司抗体（95℃，20 s）
酶活-U/μL	2.15	2.1	2.2

7 双封闭抗体可封闭多种类型Taq酶

用翌圣生物双封闭抗体（Cat#31303）分别封闭三种类型Taq酶（野生型+2种突变型），封闭比例为1μg：5U，测量荧光值以及封闭效率。可以看到，对于不同类型的Taq酶，翌圣生物双封闭抗体（Cat#31303）封闭效果均较好。

	荧光值	封闭效率
空白	6461.74
原酶-Taq000	56221.33
原酶-Taq019E	50819.64
原酶-Taq019H	56466.33
31303-Taq000	7949.68	97.01%
31303-Taq019E	8267.35	95.93%
31303-Taq019H	8015.47	96.90%

8 Yeasen双封闭抗体无小鼠基因组残留

以水为模板作为阴性对照，小鼠基因组为模板作为阳性对照，扩增不同批次的31303，观察条带，发现样品未扩增出目的片段，说明抗体不存在小鼠基因组残留。

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图8. 小鼠基因组残留检测图

注：-为阴性对照，+为阳性对照，1-5为31303不同批次样品

PART 04

翌圣生物Taq酶抗体库，满足您的多样化需求

市面上Taq酶突变体种类较多，往往很难找到适配且能高效封闭的抗体，而选择其他的修饰方式，可能存在修饰效果不佳、热启动时间过长等问题。

翌圣生物拥有多种Taq酶抗体组成的抗体库，除常用的聚合酶活性封闭抗体、5'→3'外切酶活性封闭抗体和双封闭抗体以外，抗体库中还有40余株抗体，后续可快速开发实现超过200余株抗体，可针对各种商业化Taq酶进行定制化筛选适配封闭抗体，帮助IVD企业快速适配原料缩短研发进程。

抗体库定制筛选案例展示：

2020年6月12日，客户C反馈使用翌圣生物通用版Taq酶抗体封闭某Taq酶突变体，封闭效率可达95%，但希望37℃稳定性测试能突破7天，尝试优化封闭比例未能解决该问题，遂安排寄送客户的Taq酶至翌圣生物IVD RDC。同年7月20日，翌圣生物从其Taq酶抗体库里进行筛选，筛选到#301号聚合酶封闭抗体与#2号外切酶封闭抗体对客户Taq酶有良好的封闭性，混合使用两种抗体可使Taq酶37℃稳定性测试延长至14天。

创新合作模式下的定制化封闭抗体筛选，翌圣生物Taq酶抗体库给您多种选择！

目前翌圣生物为IVD企业已提供的定制化服务除了Taq酶封闭抗体筛选外，其他分子诊断原料包括：免提取、快速程序、自动化仪器适配、小体积反应体系、酶定向改造、防污染体系、冻干试剂等，帮助数百个分子诊断试剂开发项目顺利进行，快速推向临床实验阶段。

如果您对创新合作模式感兴趣，欢迎联系我们（联系电话：18930337563）探讨交流，我们期待与您的合作！

PART 05

产品信息

产品名称	货号	规格
Hieff^® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody	31303ES60	100 μg
	31303ES80	1 mg
	31303ES90	5 mg
	31303ES92	10 mg
	31303ES93	100 mg
	31303ES94	1000 mg