细胞增殖/毒性检测方法大全(上)—

细胞增殖/毒性检测方法大全(上)——化学发光法检测

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，是生物体的重要生命特征。细胞通常以分裂的方式进行增殖。细胞毒性（cytotoxic）是由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

根据您实验室现有的实验条件，可选择使用多功能酶标仪的化学发光发检测，也可选择利用荧光显微镜或者流式细胞仪的检测。最常见的细胞增殖和毒性的检测方法有以下几种：

图1.细胞增殖/毒性检测的常见方法

细胞代谢检测

原理解读

MTT检测法

MTT是一种黄色染料，已经普遍用于细胞增殖与毒性检测。检测的原理在于：MTT是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。

CCK-8检测法

CCK-8检测应该是目前应用得比较广泛得一种细胞毒性与增殖检测方法。CCK-8是Cell Counting Kit-8的简称，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

实验操作（CCK-8）

实验所需试剂：CCK-8，PBS,培养基，胰酶

实验所需耗材：96孔板，离心管

实验流程：

图2.CCK-8实验流程

实验结果

细胞生存率体现细胞增殖/毒性

图3.不同处理因素下细胞的生存率

参考文献：Wei S, Zhao Q, Zheng K, Liu P, Sha N, Li Y, Ma C, Li J, Zhuo L, Liu G, Liang W, Jiang Y, Chen T, Zhong N. GFAT1-linked TAB1 glutamylation sustains p38 MAPK activation and promotes lung cancer cell survival under glucose starvation. Cell Discov. 2022 Aug 9;8(1):77. doi: 10.1038/s41421-022-00423-0. PMID: 35945223; PMCID: PMC9363421.

OD值体现细胞增殖/毒性

图4.不同人参皂苷Rg2浓度下细胞的生存率（OD值体现）

参考文献：Xue Q, Yu T, Wang Z, Fu X, Li X, Zou L, Li M, Cho JY, Yang Y. Protective effect and mechanism of ginsenoside Rg2 on atherosclerosis. J Ginseng Res. 2023 Mar;47(2):237-245. doi: 10.1016/j.jgr.2022.08.001. Epub 2022 Aug 6. PMID: 36926610; PMCID: PMC10014178.

细胞代谢的更多资料，详见专题：CCK-8，您细胞活力检测的专家

产品推荐

产品名称	货号	规格
MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒	40206ES76	500T
	40206ES80	1000T
	40206ES90	5000T
Cell Counting Kit（CCK-8）CCK-8试剂盒	40203ES60	100T
	40203ES76	500T
	40203ES80	1000T
	40203ES88	3*1000T
	40203ES92	10*1000T

ATP细胞活力检测

原理解读：

ATP是细胞内最重要的能量分子，可以用来衡量细胞新陈代谢水平，死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，ATP与活细胞数目具有良好的线性关系，因此，可通过ATP含量反应活细胞的数目检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。利用外源的萤火虫荧光素（Luciferin）与荧光素酶（Luciferase），以细胞内含的ATP为能量来源，发生氧化反应产生生物冷光，通过化学发光信号测定细胞内ATP 含量，从而检测细胞活力或定量检测活细胞数目并且具有灵敏度高、线性范围宽，适合高通量筛选检测。

图5.APT细胞活力检测原理图

实验操作：

实验所需试剂：ATP细胞活力检测，PBS，培养基，胰酶

实验所需耗材：96孔板，离心管

图6.ATP细胞活力检测操作示意图

实验结果

细胞外ATP泄露检测

图7.幽门螺杆菌质膜通透性检测

参考文献：Zou Y, Chen X, Sun Y, et al. Antibiotics-free nanoparticles eradicate Helicobacter pylori biofilms and intracellular bacteria [published online ahead of print, 2022 Jun 9]. J Control Release. 2022;348:370-385. doi:10.1016/j.jconrel.2022.05.044

细胞增殖检测

图8 . Na2MoO4诱导卵巢癌细胞铁死亡（Na2MoO4 induces ferroptosis of ovarian cancer cells.）

参考文献：Mao G, Xin D, Wang Q, Lai D. Sodium molybdate inhibits the growth of ovarian cancer cells via inducing both ferroptosis and apoptosis. Free Radic Biol Med. 2022;182:79-92. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2022.02.023

ATP Luminescent 细胞活力检测试剂盒更多资料，详见专题：干货分享 | ATP Luminescent 细胞活力检测试剂盒的应用

产品推荐

产品名称	货号	规格
ATP Luminescent Cell Viability Assay Kit ATP Luminescent 细胞活力检测试剂盒	40210ES10	10 mL
	40210ES60	100 mL
	40210ES80	10×100 mL

LDH法检测

原理解读：

LDH (乳酸脱氢酶）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，释放出的LDH 在培养基上清中，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT(a tetrazolium salt)被硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase)催化反应生成NAD+和红色的甲臜(Formazan)，甲臜的量与裂解的细胞数成正比，在490 nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。

图9.LDH检测原理示意图

实验操作：

实验所需试剂：乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒，PBS，培养基，胰酶

实验所需耗材：96孔板，离心管

图10.LDH法检测实验操作流程

实验结果：

LDH作为靶细胞裂解指征（OD值越高，LDH越多）

图11.由NS1靶向单克隆抗体介导的ADCC活动。乳酸的释放测量脱氢酶（LDH）作为靶细胞裂解和细胞死亡的替代标记物（ADCC activity mediated by NS1-targeted MAbs. The release of lactate dehydrogenase (LDH) was measured as a surrogate marker for target cell lysis and cell death.）

参考文献：Yu L, Liu X, Ye X, et al. Monoclonal Antibodies against Zika Virus NS1 Protein Confer Protection via Fcγ Receptor-Dependent and -Independent Pathways. mBio. 2021;12(1):e03179-20. Published 2021 Feb 9. doi:10.1128/mBio.03179-20(IF:7.867)

LDH作为靶细胞裂解指征（用细胞裂解率计算）

图12.EDB-FN CAR-T细胞在与U-87 MG细胞共培养2-24小时，（E：T）为5。使用以下方法测定细胞裂解LDH测定。（EDB-FN CAR-T-cells cocultured with U-87 MG cells at (E:T) 5 for 2–24 h. Cell lysis was determined using an LDH assay. Data are representative of three independent experiments. Datapoints reflect the mean ± SD of triplicates e.）

参考文献：Zhang Z, Liu C, Yang Z, Yin H. CAR-T-Cell Therapy for Solid Tumors Positive for Fibronectin Extra Domain B. Cells. 2022;11(18):2863. Published 2022 Sep 14. doi:10.3390/cells11182863 (IF:7.666)

图13.细胞毒性测定，通过LDH释放测定评估RAW 264.7细胞介导的LLC细胞杀伤（Cytotoxicity assay to assess the RAW 264.7 cell-mediated killing of LLC cells by LDH release assay）

参考文献：Pan M, Wang F, Nan L, et al. αVEGFR2-MICA fusion antibodies enhance immunotherapy effect and synergize with PD-1 blockade [published online ahead of print, 2022 Oct 13]. Cancer Immunol Immunother. 2022;10.1007/s00262-022-03306-1. doi:10.1007/s00262-022-03306-1(IF:6.630)

产品推荐

产品名称	货号	规格
LDH Cytotoxicity Assay Kit 乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒	40209ES76	500 T

细胞总蛋白检测

原理解读：

磺酰罗丹明（Sulforhodamine B，SRB）是一种水溶性蛋白染料，能与细胞内蛋白碱性氨基酸结合形成复合物，其结合于细胞中总蛋白量的多少可以反映细胞数的多少。在515nm波长处测得的吸光值与细胞数呈良好的线性关系。

实验操作：

实验所需试剂：磺酰罗丹明细胞增殖/毒性检测试剂盒，PBS，培养基，胰酶，4%多聚甲醛

实验所需耗材：96孔板

图14.磺酰罗丹明细胞增殖/毒性检测流程

实验结果：

以药物IC50呈现实验结果

图15.所有化合物都在五种不同的癌细胞系上进行了测试，即FaDu(咽癌)、A2780(卵巢癌)、HT29(结肠癌)、A375(恶性黑色素瘤)、SW1736(甲状腺癌)和NIH-3T3（非恶性小鼠成纤维细胞）进行比较。其中4个化合物(2,9,16和26)表现出良好的细胞毒活性，IC50值在2.1 - 14.3 μ M之间。这些化合物对A2780细胞的IC50值分别为2.8、3.8、2.1和2.9µM。（All compounds were tested on five different cancer cell lines, namely FaDu (pharynx carcinoma), A2780 (ovarian carcinoma), HT29 (colon adenocarcinoma), A375 (malignant melanoma), SW1736 (thyroid carcinoma) and non-malignant mouse fibroblast NIH-3T3 for comparison. Four of these compounds (2, 9, 16 and 26) showed good cytotoxic activity with acceptable IC50 values ranging between 2.1 and 14.3µM. These compounds exerted their best activity on A2780 cells with IC50 values of 2.8, 3.8, 2.1 and 2.9µM, respectively。）

参考文献：Moghadam ES, Tehrani MH, Csuk R, Fischer L, Faramarzi MA, Rashidi A, Javadi I, Amini M. 2,4-Disubstituted Quinazoline Derivatives Act as Inducers of Tubulin Polymerization: Synthesis and Cytotoxicity. Anticancer Agents Med Chem. 2019;19(8):1048-1057. doi: 10.2174/1871520619666190314125254. PMID: 30868963.

图16.JR6对EJ细胞增殖的影响。在96孔板中，每孔培养7000个细胞，暴露于不同浓度的JR6和阿霉素(Dox)下，并孵育48小时。（Effect of JR6 on proliferation of EJ cells. Cells were cultured at 7000 cells per well in 96-well plates, exposed to different concentrations of JR6 and Doxorubicin (Dox) and incubated for 48 h.）

参考文献：He XL, Zhang P, Dong XZ, Yang MH, Chen SL, Bi MG. JR6, a new compound isolated from Justicia procumbens, induces apoptosis in human bladder cancer EJ cells through caspase-dependent pathway. J Ethnopharmacol. 2012 Nov 21;144(2):284-92. doi: 10.1016/j.jep.2012.09.010. Epub 2012 Sep 15. PMID: 22985636.

产品推荐

产品名称	货号	规格
磺酰罗丹明B(SRB)细胞增殖和毒性检测试剂盒 SRB Cell Proliferation and cytotoxicity assay kit	40205ES76	500 T

表1.化学发光法细胞增殖/毒性检测快速选择表

方法	检测波长	细胞毒性	操作难度	灵敏度	检测用时	适用对象（常见）
CCK-8	450nm	弱	低	较高	1-4 h	普通贴壁细胞/悬浮细胞；药筛实验
ATP	560nm	弱	低	极高	10 -20 min	普通贴壁/悬浮细胞；3D细胞
LDH	490nm	弱	低	较高	30-40 min	贴壁/悬浮细胞；免疫细胞，ADCC效应细胞和靶细胞等；药筛实验
SRB	515nm	弱	中等	较高	1.5-2 h	药筛实验