磁珠加多少才合适？这篇实操指南帮你搞定片段筛选，告别“盲猜”时代

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2026-10-10

一

前言

在NGS文库构建过程中，片段筛选是决定最终文库大小分布的关键步骤。片段筛选做得不好，文库峰型不理想，就会影响测序数据质量和下机数据利用率。很多新手在做片段筛选时，往往靠“感觉”或“经验”添加磁珠比例，结果时好时坏，今天这篇文章就手把手教你掌握正确的磁珠加量方法，告别“盲猜”时代。

二

技术应用：从纯化到分选的场景覆盖

磁珠法片段筛选的原理

NGS技术中使用的羧基磁珠表面带有带负电荷的羧基基团，在特定浓度的PEG和盐离子条件下，带负电的DNA片段会通过电荷相互作用和空间位阻效应吸附到磁珠表面。当PEG浓度降低或盐离子被稀释时，DNA与磁珠的结合减弱，从而实现洗脱。

图1 DNA纯化磁珠原理示意图

大片段优先吸附：DNA分子越长，其负电荷越多，空间构象越舒展，与磁珠表面的接触面积越大，因此在相同的PEG/盐浓度下，大片段DNA会优先被磁珠吸附，而小片段（<100 bp，如引物二聚体、接头二聚体）则留在上清中被去除。

磁珠比例控制片段cutoff：加入的磁珠体积（相对于样本体积）决定了能够被吸附的最大片段大小范围：

磁珠比例越高（如1.8x），能吸附的片段范围越宽，包括相对较大的片段
磁珠比例越低（如0.6x），只能吸附较大片段，小片段留在上清

磁珠DNA纯化应用

磁珠纯化目的在于去除体系中不想要的核酸片段和杂质。由于磁珠优先吸附大片段，可通过一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丢弃上清中的非目标片段（如接头二聚体、引物二聚体），然后将磁珠吸附的目的DNA洗脱回收。

DNA双轮分选（片段筛选）

由于二代测序平台读长的限制要求，最终文库需具有较窄的片段分布范围。片段筛选的目的在于从片段化DNA中选择特定区域的目标片段。由于磁珠优先吸附大片段，第一轮磁珠吸附去除目的片段以上的大片段，保留上清中的目标片段；第二轮磁珠吸附目标片段，弃上清后将磁珠上的目的片段洗脱回收。

片段筛选的关键控制参数是磁珠与样品体积比，即“磁珠比例”。例如，目标片段平均长度为300 bp左右时，第一轮磁珠比例0.8×、第二轮0.2×。以翌圣生物纯化分选磁珠（12601ES）为例，下表列出了不同目标片段长度对应的双轮分选推荐比例。

表1磁珠文库分选推荐比例

DNA片段大小	250-350 bp	320-420 bp	450-550 bp	550-700 bp	700-900 bp	800-1000 bp
第一轮体积比（Beads：DNA）	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×	0.50×	0.45×
第二轮体积比（Beads：DNA）	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×	0.15×	0.15×

注：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp，样品 DNA 体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.80×100 μL=80 μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL。

三

实操步骤详解

所需材料

羧基磁珠（如Hieff NGS® DNA Clean Beads，12601ES），使用前恢复至室温

l 现用现配80%乙醇（无水乙醇:水=8:2）

l 磁力架

l PCR管或八联排

l 移液器及枪头等

磁珠法片段筛选的操作流程包括以下环节：

操作步骤：

1. 准备工作：将磁珠从4℃冰箱取出，室温平衡至少30分钟。使用前涡旋振荡使磁珠充分重悬（磁珠长期静置会发生沉降）；
2. 第一轮分选（去除大片段）：根据目标片段大小计算磁珠体积。使用公式：磁珠体积 = 样本体积 × 磁珠比例。例如：50 μL样本，0.8x比例，磁珠体积 = 50 × 0.8 = 40 μL；
3. 混匀结合：加入磁珠后，用移液器吹打20次以上或涡旋，确保磁珠与DNA充分混匀。室温孵育5分钟，使DNA与磁珠充分结合；
4. 磁力架吸附：将离心管置于磁力架上，静置2-5分钟，直至溶液变清澈，磁珠完全吸附到管壁一侧；
5. 转移上清：小心吸取上清（约等于原始样本量+加入的磁珠体积），转移到新的离心管中。（上清中含有所需大小的DNA片段）
6. 第二轮分选（捕获目标片段）：按推荐比例加入磁珠至第一轮上清中，充分混匀。室温孵育5分钟，使DNA与磁珠充分结合。磁力架吸附，弃上清。
7. 洗涤：加入200 μL新鲜配制的80%乙醇，室温静置30秒，去除残余盐离子和杂质。小心吸去乙醇，注意不要扰动磁珠。重复洗涤：再加入200 μL 80%乙醇，重复洗涤一次；
8. 晾干：室温晾干磁珠约5-10分钟（视情况而定），直至磁珠表面无明显光泽，但不要过度干燥（开裂会导致DNA洗脱效率下降）；
9. 洗脱：加入TE缓冲液或超纯水（体积根据需要回收的DNA量决定，通常20-50 μL），用移液器吹打10次或涡旋混匀。室温孵育5分钟，置于磁力架上，收集上清至新管。

图2 DNA分选步骤示意图

注意事项

80%乙醇必须新鲜配制，乙醇浓度下降会影响洗涤效果和DNA回收率
晾干时间要控制好：晾干不足残留乙醇会影响后续反应；晾干过度会导致磁珠开裂，DNA洗脱困难
磁珠与DNA的结合和洗脱效率受温度影响，建议在20-25℃室温下操作。

四

常见问题与解决方案

文库峰型不理想，双峰或肩峰

原因分析：

l 磁珠比例选择不当，导致部分片段被截留

l PCR扩增不均匀，出现过度扩增或非特异性扩增

l 上一步反应存在残留物干扰

解决方案：

ü 重新进行片段筛选，可微调磁珠比例（如原用1.0x可尝试0.9x或1.1x）

ü 优化PCR条件，包括退火温度和循环数

ü 增加洗涤步骤或进行第二轮磁珠纯化

文库浓度偏低

原因分析：

l DNA起始量过低

l PCR扩增循环数过低

l 晾干过度，磁珠开裂

解决方案：

ü 增加起始DNA量

ü 优化PCR循环数

ü 确保晾干适度，避免磁珠开裂

引物二聚体残留

原因分析：

l 磁珠比例过高，对引物二聚体去除不彻底

l PCR体系设计不当，产生过多引物二聚体

解决方案：

ü 降低磁珠比例

ü 优化引物设计，避免引物之间形成二聚体

ü 调整PCR程序，避免扩增产生过多二聚体

希望这篇实操指南能帮你把片段筛选做到精准、稳定！

【翌圣生物·磁珠产品推荐表】

产品类别	产品名称	货号
DNA磁珠	Hieff NGS® Smarter DNA Clean beads (50bp以上) /小片段适用的DNA纯化磁珠（ATAC和CUT&Tag适用）	12600ES
	Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠	12601ES
	Hieff NGS® DNA Selection Beads V2 DNA 分选磁珠 V2	12418ES
RNA磁珠	Hieff NGS® RNA Cleaner RNA纯化磁珠	12602ES