文献标题：EBV strain interacts with host HLA to drive nasopharyngeal carcinoma risk

期刊：Nature

发表时间：2026.04.15线上发表

研究团队：中山大学肿瘤防治中心徐淼教授团队，联合新加坡基因组研究所刘建军教授、中科院动物研究所翟巍巍教授、哥伦比亚大学刘中华教授等团队

研究创新点：首次明确揭示：EB病毒与宿主HLA基因之间的交互作用是鼻咽癌的最高危风险因素。研究人员发现HLA-A 11:01与EBV 85841G这类“高风险”病毒株之间存在遗传交互，极大幅地提升了鼻咽癌的患病风险，并阐明了其背后的免疫机制与进化历史。

研究核心：宿主与病毒基因组的逐级联合分析，揭示EB病毒（EBV）毒株与宿主HLA-A 11:01基因相互作用驱动鼻咽癌风险的分子机制。

 

文献发表Nature上的截图：https://doi.org/10.1038/s41586-026-10416-8

 

 

一. 研究样本采集与EBV病毒株准备

· 样本来源： 论文的样本主要来自两个独立的中国华南人群队列（1,391例NPC患者和2,131例对照）以及新加坡的独立人群。

· 病毒：

o B95-8株： 经典的实验室参考株（85841A型），源自传染性单核细胞增多症患者。

o Akata株： 从Burkitt淋巴瘤患者中分离的病毒株（85841G型）。

o M81株： 从鼻咽癌患者肿瘤组织中直接分离的病毒株（高风险-85841G型）。

· 病毒生产：

o 为获得高滴度的成熟病毒颗粒，研究人员使用了特定的细胞系和诱导剂。

o B95-8细胞： 在低血清（2% FBS） 的RPMI-1640培养基中悬浮培养2周，以自发触发EBV裂解周期。

o CNE2-Akata和CNE2-M81细胞： 在含10% FBS的RPMI-1640培养基中加入20 ng/mL的TPA（佛波酯）（50601ES）和2.5 mM的NaB（丁酸钠）（51501ES）进行联合诱导（12小时），以激活病毒进入裂解复制阶段。

o 诱导完成后，更换为新鲜完全培养基继续培养3天。随后收集细胞上清，过滤、超速离心浓缩病毒，-80℃冻存备用。

 

二. 建立EB病毒转化的B淋巴细胞系

这是Cyclosporin A (CsA)登场的关键实验环节。 为了获得大量可无限增殖的、感染了特定EBV毒株的B细胞以进行后续的T细胞杀伤实验，研究人员采用了经典的LCLs（淋巴母细胞样细胞系）建立技术：

 

建立EBV感染的LCLs详细实验流程：

1. 感染体系：提取自健康志愿者的PBMCs被重悬于含有特定EBV毒株（B95-8、Akata或M81）的病毒液中，细胞密度: 5×10⁵ cells/mL。

2. 离心与铺板：共同孵育感染12小时后，将细胞离心并转移到48孔板中进行培养。

3. 培养与筛选（CsA的应用细节）：

细胞在含有以下成分的RPMI-1640完全培养基中培养：

• 10% FBS（胎牛血清）（40131ES或40132ES）
• 1% GlutaMax（60701ES6）（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，一种更稳定的L-谷氨酰胺替代品）
• 1 mM Sodium Pyruvate（60370ES）（丙酮酸钠，提供能量底物）
•  Cyclosporin A (CsA)（50602ES）（关键步骤！抑制T细胞清除），关键作用在于抑制原代T细胞的活化和增殖。如果不加CsA，样本中存在的EBV特异性记忆T细胞会迅速识别并清除刚被病毒感染的B细胞，导致LCLs建系失败。因此，CsA的加入是为了暂时性地“屏蔽”T细胞免疫，为B细胞的转化和克隆增殖创造一个“免疫豁免”的环境。
• § Penicillin-Streptomycin（60162ES）（青霉素-链霉素）：防止细菌污染。

4. 换液与维持： 每周更换一半的培养基（50%体积），同时补加含2 μg/mL CsA的新鲜培养基，保持CsA浓度：2 μg/mL，以维持其免疫抑制效应。

5. 建系成功标志： 经过约4-6周的培养，B细胞成功被EBV转化并开始持续增殖，形成稳定的淋巴母细胞系(LCLs)。随后，通过EBER原位杂交和流式细胞术检测B细胞标志物（CD19）对LCLs的成功建立进行验证。

  

1. CsA 的配置与工作浓度

实验参数	详细说明
化合物名称	Cyclosporin A（环孢素 A, Cyclosporine），缩写 CsA
CAS号	59865-13-3
货号	50602ES（翌圣生物）
分子式	C62H111N11O12
分子量	1202.61
工作浓度	2 μg/mL（此为最终培养体系中的工作浓度）
配置方法	用DMSO等溶剂将CsA 粉末（Yeasen货号50602ES）配制成高浓度母液（如10 mg/mL 或10 mM），分装后 -20℃避光保存，避免反复冻融。使用时用完全培养基稀释至 2 μg/mL的工作浓度
过滤除菌	建议0.22 μm滤膜过滤除菌（不可高温高压灭菌）
作用时间	持续作用。在LCLs建立的整个周期（约4-6周）内，每次换液（每周）均需补充CsA至2 μg/mL，以维持其免疫抑制效果
作用方式	直接添加至细胞培养基中，持续存在
作用机制	CsA 与细胞内亲环素结合后，抑制钙调磷酸酶活性，从而阻止 NF-AT 转录因子的核转位，特异性抑制 T 细胞的活化和增殖
作用对象	主要靶细胞：PBMC 中的 T 淋巴细胞（包括 CD4+ 和 CD8+ T 细胞），这些T细胞是LCLs建立过程中的“干扰物”，会被CsA有效抑制； 间接保护对象：EBV 感染的 B 细胞（使其免于被 T 细胞杀伤，从而得以转化和克隆扩增）；
作用结果	成功建立永生化LCLs（淋巴母细胞系）。通过抑制T细胞的活化和增殖，CsA为EBV感染B细胞并使其转化提供了时间窗口，最终促成了稳定LCLs的建立，成功建立稳定的EBV感染的LCLs
保存稳定性	母液应避免反复冻融；工作液建议现用现配
纯度	≥99% (HPLC)

 

小结：Cyclosporin A在此步骤中的核心作用是作为一种“免疫制动剂”，通过抑制T细胞活性，确保EBV能够成功转化B细胞，从而建立可用于后续机制研究的细胞模型。

 

文献使用翌圣生物Yeasen的Cyclosporin A 环孢素A（50602ES）建立EBV感染的LCLs

 

三. T细胞功能学验证

在获得LCLs后，研究人员对这些细胞的免疫原性和杀伤机制进行了深入探究：

· 肽-HLA结合力测定： 采用生物膜层干涉技术和ELISA，鉴定出由EBV 85841G编码的“VVILENVSR”肽段能够牢固地结合到HLA-A 11:01分子上，而85841A编码的“VVILENVGQ”肽段则不能。AlphaFold3结构预测进一步从原子层面揭示了这种结合差异的分子基础。

· T细胞活化与细胞毒性实验：

o 从携带A 11:01基因且感染了高风险EBV的健康供者外周血中分离PBMCs。

o 使用特定肽段，在IL-2、IL-7、IL-15等细胞因子的支持下，进行为期13天的T细胞体外扩增，以获得大量抗原特异性的CD8+ T细胞。

o ICC：将扩增后的T细胞与目标细胞（肽段冲击的COS-7细胞、过表达特定EBNA3B的COS-7细胞或LCLs）共培养，通过检测T细胞内IFN-γ的表达水平，评估T细胞的活化状态。

o 杀伤实验： 将T细胞与表达荧光素酶的COS-7靶细胞或LCLs共培养。若靶细胞被T细胞特异性杀伤，其存活率会显著降低，反映为荧光素酶活性的下降或细胞凋亡标志物的增加。

 

四. 作用结果与验证

结果指标	结果说明
LCLs 稳定增殖	约 4–6 周后，出现典型的细胞团块，细胞持续增殖，可传代
EBER-FISH 阳性	检测EBV编码的小RNA（EBER），确认EBV基因组存在于B细胞核内
B 细胞标志物阳性	流式细胞术检测 CD19、CD20 等，确认细胞为 B 细胞来源
功能验证	成功建立的 LCLs 被用于后续的 T 细胞杀伤实验，证明其对 VVILENVSR 特异性 CD8+ T 细胞的敏感性

 

五. 核心研究成果解读

该研究通过严谨的实验设计得到了以下核心发现：

1. 鼻咽癌风险源于宿主-病毒遗传交互： 研究发现，同时具有HLA-A 11:01等位基因并感染高风险EB病毒的个体，其患病风险远高于仅携带单一风险因素的个体，并非简单的“1+1=2”效应。

2. 定位关键分子： 确定了EBV基因组上的85841G点突变是驱动这一风险交互的核心病毒变异。该突变位于EBNA3B基因内，导致其编码蛋白序列第900位氨基酸由谷氨酰胺（Q）变为精氨酸（R）。

3. 阐明分子免疫机制： 由85841G编码产生的VVILENVSR肽段，能够被HLA-A 11:01分子高效呈递到细胞表面，从而激活强有力的CD8+细胞毒性T细胞应答，有效清除被病毒感染的B细胞，控制病毒在体内的活动，降低鼻咽癌风险。而缺乏HLA-A 11:01的个体则无法有效识别该表位，从而增加了致癌风险。

4. 精准风险分层： 在华南高发区，同时具备“高风险EBV感染”和“ 易感HLA-A背景（A11:01或A02:07）”的双重风险亚群，虽然仅占总人口的20.5%，却贡献了47% 的鼻咽癌病例。

5. 病毒进化之谜： 85841G这种高风险病毒变异并非本地固有，而是约4000年前通过北方和南方EBV毒株基因重组产生的，并因某种正选择压力而在华南地区发生了克隆性扩张，最终与当地人群的HLA基因型“协同富集”，共同导致了该地区鼻咽癌的高发。

 

六. 实验用到的关键试剂整理汇总

该研究用到了大量高品质的细胞培养和分子生物学试剂，以下是根据文献整理的关键试剂及对应的Yeasen（翌圣生物）产品信息：

 

产品名称	产品货号	产品应用简介
Cyclosporin A（环孢素 A）	50602ES	建立EBV转化的B细胞系时，抑制T细胞活化的关键免疫抑制剂，工作浓度2 μg/mL，抑制T细胞活化。免疫抑制研究；器官移植抗排斥研究
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA, TPA, 佛波酯)	50601ES	PKC激活剂，用于体外激活T细胞和诱EBV裂解周期。
Sodium Pyruvate (100 mM)	60370ES	为细胞培养提供能量来源和碳骨架，支持细胞生长
Sodium Butyrate (NaB, 丁酸钠)	51501ES	组蛋白去乙酰化酶抑制剂，用于诱导EBV进入裂解复制周期
Brefeldin A	50504ES	蛋白转运抑制剂，阻断蛋白分泌，用于胞内细胞因子染色和流式检测
Brefeldin A (溶液)	50502ES	蛋白转运抑制剂，阻断蛋白分泌，用于胞内细胞因子染色和流式检测
Monensin 莫能霉素	50501ES	离子载体，阻断高尔基体转运，用于胞内染色
DMSO（二甲基亚砜，细胞培养级）	60313ES	细胞冻存液成分；CsA等化合物的溶剂
Penicillin-Streptomycin (100×)	60162ES	细胞培养中预防细菌污染的常用抗生素组合
RPMI 1640 Medium	41402ES	RPMI1640培养基
RPMI 1640 Medium (with HEPES, L-Glutamine, D-Glucose and Phenol Red， no Sodium Pyruvate) RPMI 1640培养基（含HEPES、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、酚红;不含丙酮酸钠)	41407ES	淋巴细胞和多种悬浮细胞培养的基础培养基
Fetal Bovine Serum Gold Plus 胎牛血清（特级）	40131ES	胎牛血清
Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级）	40132ES	胎牛血清
L-Alanyl-L-Glutamine (200 mM), GlutaMAX	60701ES	L-谷氨酰胺的稳定替代品，提高细胞生长效率
Water For Injection (WFI) for Cell Culture 细胞培养用注射用水	60167ES	用于细胞培养相关溶液的配制，确保无菌和无内毒素
Recombinant Human IL-2 Protein(CHO)(重组人白介素-2)	90267ES	T细胞体外扩增和激活的关键细胞因子
Recombinant Human IL-7 Protein(重组人白介素-7)	90188ES	促进T细胞存活和稳态增殖的必需细胞因子
Recombinant Human IL-15 Protein(重组人白介素-15)	90113ES	刺激T细胞和NK细胞增殖的分化因子
Luciferase Reporter Assay Kit(萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒)	11401ES	通过检测荧光素酶活性来定量评估T细胞介导的细胞杀伤效率
Lymphocyte Separation Medium 1.084 淋巴细胞分离液1.084（人单个核细胞、啮齿动物）	40504ES	人外周血单个核细胞（PBMCs）分离

 

七. 常见问题解答（FAQ）

Q1: 为什么建立LCLs时必须使用Cyclosporin A (CsA)？

A: 建立LCLs的过程，本质上是将EBV与来自同一供体的PBMC共培养。如果不用CsA，PBMC中存在的EBV特异性记忆T细胞会迅速识别并攻击新近被EBV感染的B细胞，从而阻止B细胞的转化和永生化。CsA通过抑制T细胞的钙调神经磷酸酶信号通路，阻断其活化和增殖，为EBV感染B细胞并使其成功转化提供了必要条件。

 

Q2: 如果实验中没有使用CsA，会有什么后果？

A: 未能使用CsA是LCLs建立失败的常见原因之一。后果通常是：即使EBV成功感染了B细胞，也会被供体自身的EBV特异性T细胞在几天内迅速清除。最终导致无法获得稳定增殖的LCLs，或者获得的细胞系中混杂了大量活化的T细胞，影响后续实验的准确性和可重复性。

 

Q3：CsA 母液如何无菌处理？
A：建议使用 0.22 μm 滤膜过滤除菌，不可高温高压。母液分装后-20℃保存。

 

Q4：CsA 在 4–6 周内是否会失活？
A：CsA在37℃细胞培养条件下半衰期约2–3天，因此每周换液补加是必要的。

 

Q5：能否使用其他免疫抑制剂（如 FK506）代替 CsA？
A：理论上FK506机制类似，但本研究中明确使用CsA（Yeasen, 50602ES），为保持实验一致性，不建议替换。

 

Q6：如果不加 CsA，LCLs 还能建立吗？
A：极难。除非供体本身EBV血清阴性且无EBV特异性T细胞，但大多数成年人均为EBV阳性，因此 CsA 是 LCLs 建系的必需试剂。

 

Q7: 研究中提到的“Tetramer staining”是检测什么的？

A: “四聚体染色”（Tetramer staining）是一种强大的抗原特异性T细胞检测技术。本研究中，研究人员将HLA-A 11:01分子与85841G编码的肽段（VVILENVSR）组装成荧光标记的四聚体复合物，用以“捕获”和检测样本中能够特异性识别该抗原的CD8+ T细胞。结果显示，在感染了高风险85841G EBV的健康个体中，这部分T细胞的比例显著高于NPC患者，说明这些T细胞在健康人体内起到了关键的保护作用。

 

Q8: 为什么研究者要检测外周血中CD8+ T细胞的比例和活化状态？

A: CD8+ T细胞（即细胞毒性T淋巴细胞）是人体抵抗病毒和肿瘤的核心免疫力量。通过检测它们在外周血中的比例（四聚体染色）和活化程度（IFN-γ），可以评估人体针对特定EBV抗原（如VVILENVSR）的免疫应答强度。研究发现，NPC患者体内针对这一抗原的特异性CD8+ T细胞应答较弱，而健康个体则维持着较强的免疫监视，这与NPC患病风险密切相关。

 

 

参考文献

1. Chen, Y. et al. EBV strain interacts with host HLA to drive nasopharyngeal carcinoma risk. Nature (2026). DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10416-8.