Rapamycin雷帕霉素属大环内酯类抗生素，与普乐可复的结构相似，但却有非常不同的免疫抑制机制。Rapamycin是特异性的mTOR抑制剂（IC₅₀约为0.1 nM）。Rapamycin与细胞内受体FKBP-12结合形成复合物后，直接作用于mTOR中的FRB（FKBP-12-rapamycin binding）结构域从而抑制蛋白活性。Rapamycin选择性抑制IL-2诱导的p70 S6激酶磷酸化与功能活化，也可以促使4E-BP1/PHAS1去磷酸，从而加强与eIF4E的结合并使之失活。Rapamycin能够阻断蛋白合成，诱导细胞周期停滞在G1期。

不同于FK506和其他免疫抑制剂，Rapamycin以非凋亡的方式阻断活化T细胞增殖治疗器官或骨髓移植中发生的排斥反应，比传统治疗方法副作用更少。

Rapamycin雷帕霉素结构式

客户使用本产品发表的科研文献

图1. 客户发表文章截图^[1]

研究团队采用特异性PI3K抑制剂（LY294002）、mTOR抑制剂（Rapamycin雷帕霉素）和特异性的Nrf2的siRNA来验证Nrf2的上调与PI3K/Akt通路的激活相关。

 图2.客户使用Wortmannin渥曼青霉素和Rapamycin雷帕霉素的截图^[1]

永生化人角质形成细胞（HaCaT）在含高糖（4500 mg/L）（青霉素/链霉素）和10%（v/v）胎牛血清的DMEM中，置于5% CO₂，37°C中培养。为了建立长期亚砷酸盐暴露细胞模型，HaCaT细胞连续用亚砷酸钠NaAsO₂（终浓度为1.0 μM）处理。此外，为了分析亚砷酸盐对转化细胞自噬的影响，将亚砷酸盐暴露的HaCaT细胞与自噬起始抑制剂Wortmannin渥曼青霉素（200 nM, 30 min）、自噬降解抑制剂Bafilomycin A1（100 nM, 4 h）和自噬起始激活剂Rapamycin雷帕霉素（50 nM, 4 h）预孵育，再用8 μM亚砷酸盐刺激细胞24 h。^[1]

分析亚砷酸盐对细胞转化、细胞自噬的影响。将HaCaT细胞和T-HaCaT细胞重新接触亚砷酸盐（0、2、4、6、8 μM；24 h），以评价亚砷酸盐诱导的抗氧化剂的变化。数据表明，在HaCaT和T-HaCaT细胞中，亚砷酸盐和Wortmannin渥曼青霉素预孵育后，LC3I下降；而在Bafilomycin A1或Rapamycin雷帕霉素存在的亚砷酸盐下，LC3I升高。见下图三。

图3.E. 再次暴露于亚砷酸盐（8 μM）之前，分别用Wortmannin（30 min）、Bafilomycin A1（4 h）、Rapamycin（4 h）的HaCaT细胞对LC3II/LC3I进行免疫印迹分析 F. LC3II/LC3I在HaCaT和T-HaCaT细胞中的相对表达^[1]

为了分析Nrf2与砷诱导HaCaT细胞的相互作用，我们采用特异性siRNA和激活剂检测Nrf2、p62、LC3、Bcl2和Beclin1在HaCaT细胞和T-HaCaT细胞中的表达情况。如下图所示，长期暴露于亚砷酸盐后，转染的T-HaCaT细胞中Beclin1和LC3iIi/LC3I的表达增加，Nrf2、p62和Bcl2的表达显著降低。经自噬激活剂Rapamycin雷帕霉素处理后，T-HaCaT细胞中Beclin1和LC3II/LC3I的表达水平显著增加。见下图四。

 图4.C+D. 免疫blot分析，HaCaT细胞和雷帕霉素（Rapa）处理的T-HaCaT细胞中Beclin1、LC3II/LC3I、p62和Nrf2的(D)相对表达水平^[1]

为了探讨Nrf2与PI3K/Akt/mTOR信号通路之间的关系，我们分别将Nrf2 siRNA、PI3K抑制剂（LY294002）和mTOR抑制剂（Rapamycin雷帕霉素）应用于T-HaCaT细胞。LY294002抑制了PI3K的激活，导致p-Akt、p-mTOR和Nrf2的表达显著降低，同时在T-HaCaT细胞中，Beclin1和LC3II/LC3I的诱导量显著增加。转染了Nrf2 siRNA显著降低了p-mTOR和p62的表达，但增加了T-HaCaT细胞中Beclin1和LC3II/LC3 I的诱导表达。

与对照组相比，p-PI3K和p-Akt的诱导率无显著性差异。此外，我们还使用mTOR抑制剂（Rapamycin雷帕霉素）验证了Nrf2和mTOR之间的关系。

Rapamycin雷帕霉素抑制的mTOR激活诱导Beclin1和LC3II/LC3的表达显著增加，而在T-HaCaT细胞中Nrf2和p62的表达没有显著变化，见下图五。这些数据表明，亚砷酸盐通过PI3K/Akt通路促进Nrf2的上调，并与上调-调节其下游的mTOR，从而抑制HaCaT细胞中的自噬起始。

图5.E+F. Western blot分析和m-TOR、Nrf2、Beclin1、LC3II/LC3 I和p62在HaCaT细胞和雷帕霉素（Rapa）（50 nM）处理的T-HaCaT细胞中的相对表达水平^[1]

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Rapamycin雷帕霉素图谱（HPLC）

[1] Wu J, et al. Long-term arsenite exposure decreases autophagy by increased release of Nrf2 in transformed human keratinocytes. Sci Total Environ. 2020 Sep 10;734:139425. doi: 10.1016/j.scitotenv.2020.139425. Epub 2020 May 13. PMID: 32450402.