干细胞&小分子化合物 | MESCs间充质胚胎干细胞培养全流程指南
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2026-04-27
随着再生医学、组织工程及细胞治疗领域的快速崛起，间充质胚胎干细胞（Mesenchymal Embryonic Stem Cells, MESCs）凭借其强大的自我更新能力、多向分化潜能及免疫调节特性，成为近年生命科学研究的核心热点。MESCs源自胚胎发育早期的中胚层和外胚层，可从囊胚内细胞团（ICM）或胚胎间质组织中分离获得，既能在体外特定条件下维持未分化状态，又能定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种间质细胞类型，同时可分泌多种细胞因子调控微环境，为疾病建模、药物筛选、组织修复及细胞替代治疗提供了理想的种子细胞来源。
与成体间充质干细胞（MSCs）相比，间充质胚胎干细胞具有干性更强、分化潜能更广泛、增殖能力更旺盛的独特优势，且免疫原性更低，在异种移植及临床转化研究中展现出更广阔的应用前景。近五年，随着单细胞转录组分析等技术的突破，科研人员对MESCs的鉴定、培养机制的认知不断深化，其体外培养体系逐步实现标准化，但该细胞对培养环境的敏感性较高，对试剂纯度、细胞因子配比及培养条件精度要求严苛，核心通过添加特异性生长因子、小分子化合物及优化培养基质，模拟体内胚胎间质微环境，实现MESCs的稳定扩增与干性维持。目前，MESCs培养技术已在骨再生、免疫疾病治疗等领域取得重要进展，为后续临床转化奠定了坚实基础。
间充质胚胎干细胞培养所需的化合物、生化试剂、细胞因子、耗材等：
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产品名称 |
货号 |
应用场景 |
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bFGF重组蛋白 |
近五年MESCs培养核心生长因子，促进细胞增殖，协同其他因子维持干性，提升细胞克隆形成率，适配无血清培养体系，浓度推荐10-30ng/mL |
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PDGF-BB重组蛋白 |
血小板衍生生长因子，协同bFGF发挥作用，调控MESCs增殖与贴壁，抑制早期分化，适配无血清培养体系，推荐浓度5-15ng/mL |
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TGF-β1重组蛋白 |
转化生长因子，维持MESCs多能性，抑制分化，促进细胞间连接，优化培养体系稳定性，推荐浓度3-7ng/mL |
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Y-27632 |
Rho激酶抑制剂，减少MESCs复苏及传代过程中的凋亡，提升细胞活力，尤其适用于低代次细胞培养，推荐浓度10μM |
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无血清培养基（MESCs专用） |
近五年主流专用培养基，以DMEM/F12为基础，添加人转铁蛋白、胰岛素等成分，无动物源污染，支持MESCs原代及长期传代培养，pH值7.2-7.4 |
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HEPES溶液 |
维持培养基pH稳定在7.2-7.4，适配MESCs生长的酸碱环境要求，减少环境波动对细胞干性的影响，保障培养体系稳定性 |
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重组胰蛋白酶消化液 |
用于MESCs传代时的细胞消化，温和高效，避免消化过度导致细胞损伤或分化，预温至37℃使用，孵育时间1-2分钟 |
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基质胶（Matrigel） |
模拟体内细胞外基质，促进MESCs贴壁生长，维持其形态完整性及干性，铺板后37℃孵育30分钟至完全凝固，现配现用 |
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青霉素-链霉素（双抗） |
青霉素：杀灭革兰氏阳性菌；链霉素：杀灭革兰氏阴性菌，杜绝培养体系微生物污染，添加比例1%，过滤除菌后使用 |
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金属浴 |
用于试剂溶解、消化液孵育，保障培养过程中温度稳定性，避免温度波动影响细胞活力及干性维持 |
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血清移液管（5mL） |
用于细胞悬液转移、试剂分装，符合无菌操作要求，避免交叉污染，适配MESCs精细培养需求 |
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吸头（10μL/200μL） |
精准移液，避免交叉污染，适配生长因子、小分子化合物等试剂的精细添加，保障培养体系配比精准 |
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锥形离心管（15mL/50mL，无菌） |
用于细胞离心、重悬，保障细胞沉淀完整性，符合无菌培养标准，适配MESCs离心（500g）需求 |
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24孔培养板（无菌） |
用于MESCs复苏、传代培养，便于显微镜下观察细胞形态，筛选无分化迹象的细胞克隆，接种密度适配2.5～4×10⁴个活细胞/cm² |
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针头过滤器（0.22μm，无菌） |
用于培养基及试剂过滤除菌，杜绝微生物污染，保障培养体系无菌性，适配无血清培养基除菌需求 |
培养方案
1、将储存有间充质胚胎干细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中，轻轻晃动1-2分钟，确保冻存液完全融化（避免反复冻融，减少细胞损伤，冻存管暴露室温时间尽量缩短）。
2、将冻存管内的细胞悬液缓慢转移至15mL无菌锥形离心管中，沿管壁缓慢加入5mL预温至37℃的MESCs基础培养基，用血清移液管轻轻吹打2-3次，轻柔重悬细胞（避免剧烈吹打，防止细胞破裂，保护细胞干性）。
3、设置离心机转速为500g，离心3分钟，使间充质胚胎干细胞充分沉淀，随后缓慢弃去上清液（避免吸弃沉淀，减少细胞损失，保留细胞沉淀完整性）。
4、用1 mL含10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）的MESCs完全培养基重悬细胞，轻轻吹打3-4次，确保细胞分散均匀，无明显细胞团块（Y-27632可显著提升复苏细胞活力，降低凋亡率）。
5、提前将基质胶铺于24孔培养板，置于37℃培养箱中孵育30分钟，待基质胶完全凝固后，将重悬后的细胞悬液加入孔中，每孔接种量控制在2.5×10⁴-4×10⁴个活细胞/cm²，适配MESCs贴壁生长需求。
6、将24孔培养板放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中，孵育24小时，待细胞贴壁后，更换新鲜的MESCs完全培养基（去除残留冻存液及凋亡细胞，为细胞生长提供充足营养）。
7、复苏后2-3天，在显微镜下观察细胞形态，筛选出形态均一、呈梭形或多边形、折光性强、无分化迹象的细胞克隆，用于后续培养（排除分化细胞，保障培养细胞的干性纯度）。
1、复苏后的间充质胚胎干细胞贴壁生长，当细胞融合度达到70%-80%时，及时更换新鲜的完全培养基（此时细胞活力最佳，避免融合度过高导致细胞接触抑制、分化或活力下降）。
2、完全培养基配制：无血清培养基（MESCs专用）+10 ng/mL bFGF+5 ng/mL PDGF-BB+5 ng/mL TGF-β1+1%双抗（青霉素-链霉素）（Cat# 60162ES），用0.22 μm针头过滤器过滤除菌后，4℃保存，有效期不超过1周（无血清体系可降低动物源污染，精准配比生长因子维持细胞干性）。
3、维持培养期间，每2天更换一次完全培养基，更换时沿管壁缓慢加入，避免冲击细胞贴壁层；同时在显微镜下观察细胞形态，若出现分化迹象（细胞形态变扁、失去梭形结构、克隆边缘模糊），及时更换培养基并调整生长因子浓度（适当提高bFGF浓度，抑制分化）。
4、培养环境控制：严格维持37℃、5% CO₂、饱和湿度，CO₂浓度波动不超过±0.5%，温度波动不超过±0.3℃，避免环境变化导致细胞分化或凋亡；培养板需定期更换，一般每3-4天更换一次，减少细胞代谢废物积累，优化培养微环境。
5、维持培养1-2周后，细胞克隆数量显著增加，可进行传代培养（传代时机选择在细胞融合度70%-80%，此时细胞活力最佳，传代后增殖速度最快，且干性维持效果最好）；维持培养期间可定期进行支原体检测，排除污染影响。
1、传代前，将MESCs完全培养基、0.25%重组胰蛋白酶消化液、PBS缓冲液预温至37℃，做好无菌操作准备（预温试剂可减少对细胞的温度刺激，提升细胞活力）。
2、弃去24孔培养板中的旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞表面2次，弃去冲洗液，去除残留的血清和代谢废物（避免影响消化效果，防止血清抑制胰蛋白酶活性）。
3、每孔加入200 μL 0.25%重组胰蛋白酶消化液，轻轻晃动培养板，使消化液均匀覆盖细胞表面，置于37℃培养箱中孵育1-2分钟，显微镜下观察到大部分细胞变圆不贴壁时，立即终止消化（避免消化过度导致细胞损伤、分化或死亡）。
4、每孔加入500 μL无血清培养基，轻轻吹打3-4次，终止消化反应；随后将细胞悬液转移至15mL无菌锥形离心管中（无血清培养基终止消化，避免血清成分干扰后续培养）。
5、500 g离心3分钟，弃去上清液，用2 mL MESCs完全培养基重悬细胞，轻轻吹打，使细胞分散为单个细胞或小克隆（避免细胞团块形成，保障传代后细胞均匀生长）。
6、将重悬后的细胞悬液按1:2的比例接种至新的基质胶包被的24孔培养板中，每孔加入适量完全培养基，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布（MESCs推荐传代比例1:2，避免传代比例过高导致细胞活力下降）。
7、将培养板放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，24小时后观察细胞贴壁情况，贴壁后更换新鲜完全培养基，继续维持培养（及时更换培养基，去除未贴壁凋亡细胞）。
8、传代过程中，可收集少量细胞进行多能性鉴定（检测CD44、CD73、TM4SF1等表面标志物），确保传代后的细胞仍维持未分化状态；传代次数建议不超过10代，避免细胞增殖能力下降或分化潜能改变，尽量使用低代次细胞进行实验。
图1. 无血清扩增的人间充质干细胞（MSCs）的分化能力[2]
参考文献
1. Zhang P, Dong J, Fan X, Yong J, Yang M, Liu Y, Zhang X, Lv L, Wen L, Qiao J, Tang F, Zhou Y. Characterization of mesenchymal stem cells in human fetal bone marrow by single-cell transcriptomic and functional analysis. Signal Transduct Target Ther. 2023 Mar 31;8(1):126. doi: 10.1038/s41392-023-01338-2. PMID: 36997513; PMCID: PMC10063684.
2. Chase LG, Lakshmipathy U, Solchaga LA, Rao MS, Vemuri MC. A novel serum-free medium for the expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 2010 Apr 2;1(1):8. doi: 10.1186/scrt8. PMID: 20504289; PMCID: PMC3226302.
3. Sufen G, Xianghong Y, Yongxia C, Qian P. bFGF and PDGF-BB have a synergistic effect on the proliferation, migration and VEGF release of endothelial progenitor cells. Cell Biol Int. 2011 May;35(5):545-51. doi: 10.1042/CBI20100401. PMID: 20961291.
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