• SET-2细胞：人急性髓系白血病细胞系，用于蛋白质组学和泛素化组学分析

• MOLM-13细胞：人急性髓系白血病细胞系，用于降解报告基因检测

• K562细胞：人慢性髓系白血病细胞系，用于免疫共沉淀实验

• 293T细胞：人胚肾细胞系，用于转染和蛋白相互作用研究

实验步骤：

细胞处理：SET-2细胞分别用DMSO（Cat# 60313ES）（n=3）或1 μM UM171（Cat# 736270ES）处理6小时

2. 蛋白提取：裂解细胞，提取总蛋白

3. 蛋白定量：使用BCA法测定蛋白浓度

4. 还原烷基化：用DTT（Cat# 20311ES）和碘乙酰胺（Cat# 52598ES）处理

5. 酶切消化：用Lys-C和胰蛋白酶（trypsin）（Cat# 40127ES）消化蛋白

6. TMT标记：使用TMTPro18标记试剂标记肽段，每个样品用不同TMT标签标记

7. 肽段分级：高pH反相肽段分级分离（21个梯度，7.5-55%乙腈）

8. 质谱分析：在Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪上进行DDA-SPS-MS3分析，全扫描分辨率：60,000，MS2和MS3分辨率：50,000

9. 数据分析：使用Proteome Discoverer软件进行蛋白质鉴定和定量

实验结果：

• UM171（Cat# 736270ES）处理导致CoREST、LSD1、HDAC1、HDAC2显著下调

• 这些蛋白是CoREST核心抑制因子复合物的核心组分

• 下调程度在Volcano图中以蓝色和红色点表示（Fig. 1b）

图1 UM171（Cat# 736270ES）诱导的CoREST降解依赖于HDAC1/2相互作用

（图片来源于文献https://doi.org/10.1038/s41586-024-08532-4）

实验步骤：

细胞处理：SET-2细胞用DMSO（Cat# 60313ES）（n=3）或1 μM UM171（Cat# 736270ES）处理90分钟

2. 蛋白提取：在含有10 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）（Cat# 55629ES）和去泛素化酶抑制剂的裂解液中裂解细胞

3. 胰蛋白酶消化：消化蛋白产生肽段

4. K-ε-GG肽段富集：使用偶联泛素化赖氨酸抗体（K-ε-GG）的磁珠，富集泛素化修饰的肽段

5. TMT标记：富集的肽段用TMTPro18标记

6. 质谱分析：在Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪上分析

7. 数据分析：鉴定泛素化位点并进行定量比较

实验结果：

• CoREST、LSD1、HDAC1和HDAC2在UM171（Cat# 736270ES）处理后早期即发生显著泛素化

• 红色点表示经Benjamini-Hochberg校正后调整P值<0.05的显著泛素化位点（见下图）

• 泛素化发生在蛋白酶体降解之前，证实UM171（Cat# 736270ES）诱导的泛素化是降解的原因

图2 UM171诱导的CoREST降解依赖于HDAC1/2相互作用，SET-2细胞经DMSO（n=3）

或1 µM UM171（n=3）处理90分钟后全球泛素化位点定量（K-ε-GG肽段）

（图片来源于文献https://doi.org/10.1038/s41586-024-08532-4）

实验步骤：

1. 载体构建：构建CoREST-GFP-IRES-mCherry报告基因载体，IRES（内部核糖体进入位点）确保GFP和mCherry等量表达，mCherry作为内参对照，GFP融合在CoREST上用于监测降解

2. 细胞转导：使用慢病毒转导MOLM-13细胞，嘌呤霉素（Cat# 60210ES）筛选：1 μg/ml，筛选3-5天，获得稳定表达细胞系

– 药物处理：用不同浓度UM171（Cat# 736270ES）（0.001-10 μM梯度稀释）或0.1% DMSO（Cat# 60313ES）处理，处理时间：6小时或24小时

3. 流式细胞术检测：使用NovoCyte 3000RYB流式细胞仪，检测GFP（绿色荧光）和mCherry（红色荧光），计算GFP/mCherry荧光比值的几何均值

4. 数据分析：药物处理样品比值归一化至DMSO对照，绘制剂量-反应曲线

关键对照实验：

• MLN4924（Cat# 53251ES）处理：1 μM，3小时预处理，阻断CRL泛素连接酶活性，证实降解依赖CRL3^KBTBD4

• 截短体分析：构建CoREST缺失突变体，鉴定降解所需的结构域

实验结果：

• UM171（Cat# 736270ES）剂量依赖性地降低GFP/mCherry比值，表明CoREST降解

• CoREST的ELM2结构域是降解所必需的

• MLN4924（Cat# 53251ES）完全阻断UM171（Cat# 736270ES）诱导的降解，证实依赖CRL3^KBTBD4泛素连接酶

图3 流式细胞术定量MOLM-13细胞，这些细胞经DMSO或UM171处理24小时，

并表达所指示的CoREST–GFP报告基因（f）和所指示的共抑制因子–GFP报告基因

（图片来源于文献https://doi.org/10.1038/s41586-024-08532-4）

实验步骤：

1. 转染：293T细胞转染HA-KBTBD4和CoREST-FLAG构建体，使用PEI或脂质体转染试剂

2. 药物处理：转染后24小时，用UM171（Cat# 736270ES）（1 μM）或DMSO（Cat# 60313ES）处理1小时，同时用MLN4924（Cat# 53251ES）（1 μM）处理3小时阻断泛素化（可选）

3. 细胞裂解：用含有蛋白酶抑制剂和去泛素化酶抑制剂的NP-40裂解液（Cat# 20121ES）裂解细胞，冰上孵育30分钟，14,000 rpm离心10分钟，收集上清

4. 免疫沉淀：加入抗HA抗体偶联的磁珠或琼脂糖珠，4°C旋转孵育2-4小时或过夜

5. 洗涤：用裂解液洗涤珠子3-5次，去除非特异性结合蛋白

6. 洗脱与检测：用SDS样品缓冲液洗脱蛋白，Western blot检测：抗FLAG抗体检测CoREST-FLAG、抗HA抗体检测KBTBD4-HA

关键实验变体：

• 截短体分析：构建CoREST缺失突变体（如CoREST(4-241)、CoREST(4-189)），鉴定与KBTBD4相互作用的最小区域

• 竞争性实验：加入过量UM171或DMSO，评估相互作用的特异性

实验结果：

• UM171（Cat# 736270ES）诱导KBTBD4与CoREST的相互作用

• CoREST(4-241)-FLAG足以与HA-KBTBD4相互作用

• CoREST(4-189)-FLAG无法与KBTBD4相互作用，表明关键相互作用区域位于189-241氨基酸之间

• MLN4924（Cat# 53251ES）阻断泛素化但不阻断相互作用，证实UM171诱导的是稳定的复合物形成

实验目的：验证UM171是否直接结合KBTBD4，以及结合是否依赖其他蛋白。

实验材料：

• JL1：UM171的四甲基罗丹明（TAMRA）偶联衍生物（荧光探针）

• 重组蛋白：KBTBD4（全长或截短体）、LHC复合物（LSD1-HDAC1-CoREST）、单独的LSD1、HDAC1、HDAC2、CoREST

• InsP6（肌醇六磷酸）（Cas# 725646ES，725643ES）：50 μM

• SAHA（Cat# 51408ES）：HDAC抑制剂，用于竞争实验

实验步骤：

1. 蛋白准备：纯化重组KBTBD4和LHC复合物，测定蛋白浓度

2. 反应体系：在384孔黑板中加入：JL1（50 nM），KBTBD4（梯度浓度）、LHC或其他蛋白组分，InsP6（肌醇六磷酸）（Cas# 725646ES，725643ES）（50 μM），缓冲液（50 mM HEPES（Cat# 60117ES） pH 7.5, 100 mM NaCl（Cat# 730341ES）, 1 mM TCEP（Cat# 731737ES））

3. 孵育：室温孵育30-60分钟，避光

4. 检测：使用荧光偏振酶标仪，激发波长：535 nm，发射波长：580 nm

5. 竞争实验：加入梯度稀释的SAHA（Cat# 51408ES）（0.001-100 μM），或加入未标记的UM171（竞争JL1结合）

实验结果：

• JL1仅在与KBTBD4和LHC同时存在时显示结合信号

• 单独的LSD1-CoREST、HDAC1或HDAC2均不足以支持JL1-KBTBD4结合

• InsP6是必需的，缺少InsP6时无结合信号

• SAHA剂量依赖性地阻断FP信号，IC50与其对HDAC1/2的亲和力相当，表明UM171结合位点与SAHA重叠或邻近

图4 HDAC1介导LHC–UM171–KBTBD4三元复合物的形成

（图片来源于文献https://doi.org/10.1038/s41586-024-08532-4）

图5 HDAC1介导LHC–UM171–KBTBD4三元复合物的形成

（图片来源于文献https://doi.org/10.1038/s41586-024-08532-4）

实验目的：验证UM171-KBTBD4复合物是否影响HDAC1的酶活性。

实验材料：

• 重组核小体：作为底物，含有乙酰化组蛋白H3（特别是H3K9ac）

• LHC复合物：纯化的LSD1-HDAC1-CoREST复合物

• KBTBD4：重组蛋白

• UM171（Cat# 736270ES）：10 μM

• 抗体：抗H3K9ac抗体（用于检测去乙酰化）

实验步骤：

1. 反应体系：在96孔板中加入：

• 重组核小体（50 nM）

• LHC复合物（10 nM）

• KBTBD4（100 nM，可选）

• UM171（Cat# 736270ES）（10 μM）或DMSO（Cat# 60313ES）

• 反应缓冲液（50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% BSA）

2. 反应条件：37°C孵育30-60分钟

3. 终止反应：加入含有SDS的样品缓冲液，煮沸5分钟

4. Western blot检测：用抗H3K9ac抗体检测乙酰化水平，用抗H3抗体作为上样对照

实验结果：

• UM171（Cat# 736270ES）仅在KBTBD4存在时抑制LHC的去乙酰化酶活性

• 单独的UM171或KBTBD4不影响HDAC1活性

• 表明E3连接酶复合物的形成阻碍了HDAC1活性位点，支持结构学发现

实验目的：定量检测UM171诱导的KBTBD4与LHC复合物之间的相互作用。

实验材料：

• 荧光素标记的LHC：供体荧光团

• His-KBTBD4：带His标签

• 抗His CoraFluor-1标记抗体：受体荧光团（铕螯合物）

• UM171（Cat# 736270ES）：梯度稀释（0.001-100 μM）

• 384孔黑板

实验步骤：

1. 反应体系：在384孔板中加入：

• 荧光素-LHC（10 nM）

• His-KBTBD4（50 nM）

• 抗His CoraFluor-1抗体（2 nM）

• UM171（梯度浓度）

• 缓冲液（50 mM HEPES（Cat# 60165ES） pH 7.5, 100 mM NaCl（Cat# 730341ES）, 0.01% Tween-20（Cat# 60305ES）, 1 mM TCEP（Cat# 20330ES））

2. 孵育：室温孵育1小时，避光

3. 检测：使用TR-FRET酶标仪，激发波长：340 nm（铕螯合物激发），发射波长：665 nm（受体）和620 nm（供体），计算665/620比值

实验结果：

• UM171剂量依赖性地增强TR-FRET信号

• 计算EC50值，定量UM171诱导复合物形成的效力

• 信号增强表明UM171促进了KBTBD4与LHC的接近

实验目的：在体外重建UM171诱导的CoREST泛素化，证实UM171直接促进泛素连接酶活性。

实验材料：

• CRL3^KBTBD4复合物：纯化的泛素连接酶，包含：CUL3、RBX1、KBTBD4

• LHC复合物：荧光素标记，作为底物

• 泛素化反应组分：E1泛素激活酶（UBE1），E2泛素结合酶（UbcH5b或Ube2D3），泛素（Ub），ATP

• UM171（Cat# 736270ES）：10 μM

• MG132（Cat# 52801ES）：蛋白酶体抑制剂（10 μM，防止底物降解）

实验步骤：

1. 反应体系：在37°C预热的反应缓冲液中加入：

• E1（50 nM）

• E2（200 nM）

• 泛素（5 μM）

• ATP（2 mM）

• CRL3^KBTBD4（50 nM）

• 荧光素-LHC（100 nM）

• UM171（Cat# 736270ES）（10 μM）或DMSO

• MG132（Cat# 52801ES）（10 μM）

2. 反应条件：37°C孵育30-90分钟，定时取样（0、15、30、60、90分钟）

3. 样品处理：加入SDS样品缓冲液终止反应，煮沸5分钟

4. 检测：Western blot用抗CoREST抗体检测泛素化条带，用抗荧光素抗体检测LHC，观察高分子量泛素化梯状条带

实验结果：

• UM171显著促进CoREST的体外泛素化

• 出现高分子量泛素化梯状条带，表明多聚泛素链形成

• DMSO对照组泛素化水平很低

• 证实UM171直接增强CRL3^KBTBD4对CoREST的泛素化活性

实验目的：解析UM171诱导的CRL3^KBTBD4-LHC复合物的高分辨率结构，阐明分子机制。

实验材料：

• KBTBD4：全长重组蛋白

• LHC复合物：纯化的LSD1-HDAC1-CoREST

• UM171（Cat# 736270ES）：10 μM

• InsP6（肌醇六磷酸）（Cas# 725646ES，725643ES）：50 μM

• 去垢剂：CHAPS或DDM（用于稳定膜蛋白）

实验步骤：

1. 复合物组装：将KBTBD4、LHC、UM171和InsP6在冰上孵育30分钟，摩尔比：KBTBD4:LHC = 2:1

2. 样品纯化：用凝胶过滤色谱（Superose 6 Increase）纯化复合物，收集复合物峰，浓缩至3-5 mg/ml

3. 冷冻样品制备：使用Vitrobot或类似设备，将3 μL样品加到Quantifoil R1.2/1.3铜网上，blotting 3-5秒，液氮冷冻

4. 数据采集：使用300 kV冷冻电镜（如Titan Krios），放大倍数：105,000×或130,000×，像素大小：0.83 Å或0.65 Å，总剂量：50-60 e⁻/Ų

5. 图像处理：使用MotionCor2进行运动校正，使用CTFFIND4或Gctf估计对比度传递函数，使用cryoSPARC或RELION进行粒子挑选和分类，3D分类和精细化，最终分辨率：3.77-3.86 Å

6. 模型构建：使用AlphaFold2预测KBTBD4、HDAC1、LSD1、CoREST结构，在COOT中进行手动模型调整，使用Phenix进行结构精细化

关键结构发现：

• 不对称组装：单个UM171分子使一对KELCH-repeat propeller结构域招募HDAC1催化域

• UM171结合位点：位于HDAC1活性位点边缘，与SAHA结合位点重叠

• 双分子胶机制：UM171桥接KBTBD4与HDAC1，InsP6稳定KBTBD4-HDAC1-CoREST界面

• 催化抑制：一个KBTBD4 propeller部分遮蔽HDAC1活性位点，解释了酶活性抑制

实验目的：在全基因组水平鉴定影响UM171诱导降解的功能性残基。

实验材料：

• 碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）：BE4max，腺嘌呤碱基编辑器（ABE）：ABEmax

• sgRNA文库：针对KBTBD4和HDAC1基因的全基因sgRNA

• MOLM-13 CoREST-GFP细胞：降解报告基因细胞系

• UM171（Cat# 736270ES）：1 μM

• 流式细胞仪：用于分选

实验步骤：

1. 文库构建：设计覆盖KBTBD4和HDAC1全编码区的sgRNA，每个基因设计约100-200条sgRNA，将sgRNA克隆到慢病毒载体

2. 细胞转导：用慢病毒转导MOLM-13 CoREST-GFP细胞，感染复数（MOI）<0.3，确保每个细胞整合单个sgRNA

3. 碱基编辑器表达：转导表达BE4max或ABEmax的慢病毒

4. 筛选：用UM171（Cat# 736270ES）（1 μM）处理细胞7天，使用流式细胞仪分选：GFP高表达群体：对UM171耐药，降解功能丧失；GFP低表达群体：对UM171敏感，正常降解

5. 测序分析：提取基因组DNA，PCR扩增靶区域，深度测序鉴定碱基编辑事件，分析富集的突变位点

验证实验：生成HDAC1单克隆细胞系：sgD99：D99位点突变、sgG202-2：G202位点突变、sgY204-1：Y204位点突变（UM171结合位点）、sgT208：T208位点突变、sgL211：L211位点突变（KBTBD4-A接触位点）

实验结果：

• HDAC1中的D99G、G202、Y204等突变完全阻断UM171诱导的KBTBD4-HDAC1共免疫沉淀

• 生成HDAC2-null HDAC1(E203G/Y204C)和HDAC1-null HDAC2(E204G/Y205C)细胞系

• 证明HDAC1和HDAC2在UM171诱导的降解机制中功能冗余

图6 KBTBD4-UM171-HDAC1-CoREST复合物的整体结构

（图片来源于文献https://doi.org/10.1038/s41586-024-08532-4）