实验所用试剂清单

类别	货号	产品名称
DNA 建库	12972ES	Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4
磁珠	12601ES	Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠
定量	12642ES	1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂
接头	12327ES	Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®Set1（板式，1-96 Index）
自备材料	—	无水乙醇

 

实验前准备

1、磁珠使用前应先平衡至室温；

2、配制80%乙醇

3、接头2倍稀释。

4、按照下表中的量准备样本。

序号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
类型	小鼠皮肤样本							小鼠心脏样本
投入量	30 ng	50 ng	30 ng	50 ng	30 ng	30 ng	50 ng	30 ng	30 ng	50 ng	50 ng	100 ng

 

 

实验条件

 

操作步骤

一、DNA片段化/末端修复/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)

将表1各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。参考表格反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表1. DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应

反应体系		反应程序
名称	体积 (μL)	温度	时间
Input DNA	X	热盖105℃	On
Smearase® Buffer 4.0	10	4℃	1 min
Smearase® Enzyme 4.0	10	35℃	15 min
ddH2O	Up to 60	72℃	20 min
-	-	4℃	Hold

二、接头连接 (Adapter Ligation)

需要根据Input DNA量稀释Adapter至合适浓度，本次使用的UDI接头稀释2倍。

将表2中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。参考表2设置反应程序，进行接头连接反应。

表2.  接头连接反应

名称	体积 (μL)	温度	时间
dA-tailed DNA	60	-	-
Ligation Enhancer 4.0	30*	热盖	Off
Rapid DNA Ligase 4.0	10	20℃	15 min
PE Adapter	5	4℃	Hold
ddH2O	Up to 110	-	-

【注】：*Ligation Enhancer比较粘稠，使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

三、连接产物磁珠纯化 (Post Ligation Clean Up)

该步骤使用磁珠对接头连接产物进行纯化。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。

本次采用接头连接后先纯化再分选方案，连接产物先进行0.6×纯化，102 μL ddH₂O洗脱后再按0.62×/0.15×比例分选，最终洗脱产物20 μL进行下一步扩增反应。

三、文库扩增 (Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。参考表3进行文库扩增反应体系配制和程序设置。

 

 

表3.  文库扩增反应

四、扩增产物磁珠纯化

扩增后产物使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)纯化。

质检结果

序号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
类型	皮肤样本							小鼠心脏样本
投入量	30ng	50ng	30ng	50ng	30ng	30ng	50ng	30ng	30ng	50ng	50ng	100ng
文库浓度（ng/μL）	32.4	54.2	61	85	75.6	75.6	92.2	31.6	31.2	43.6	43	63.2
总量 ng	810	1355	1525	2125	1890	1890	2305	790	780	1090	1075	1580
Qsep主峰	499bp	480bp	479bp	484bp	502bp	492bp	494bp	504bp	524bp	516bp	518bp	519bp

 

文库Qsep峰图

 

实验结果分析

小鼠皮肤核心脏样本采用酶切法建库试剂盒12972ES在自动化工作站MGISP-960建库，文库产量高，文库片段集中，满足质控标准。