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Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®是针对MGI®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPE DNA样本的建库。经测序验证，不同GC含量的样本，均可获得优异的测序结果，文库覆盖度高，均一性好，偏好性低，使建库变得更加简单高效。
- 适用10 ng-1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本
- 高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性
- 片段化、末端修复/加A一步完成
- 强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量
- 适用于FFPE DNA样本
- 严格的批次性能与稳定性质控
产品组分
|
组分编号与名称 |
13321ES16 |
13321ES96 |
||
|
13321-A |
|
Smearase® Mix |
160 μL |
960μL |
|
13321-B |
|
Ligation Enhancer |
480 μL |
4×720μL |
|
13321-C |
|
Fast T4 DNA Ligase |
80 μL |
480μL |
|
13321-D |
|
2×Ultima HF Amplification Mix |
400 μL |
4×600μL |
|
13321-E |
|
Primer Mix for MGI® |
80 μL |
480μL |
运输与保存方法
冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
二、关于DNA片段化
1. 本试剂盒兼容范围为10 ng – 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高质量Input DNA。
2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化。
3. 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表5，本试剂盒片段化偏好低，耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本，酶切时间参考表6。以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。
4.为保证优质精确的片段化效果，片段化反应配制过程请于冰上操作。
5. 针对FFPE DNA建库，若样本质量不佳，客户对当前建库产量不满意，可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复，具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行，无需额外的操作。
三、关于接头连接（Adapter Ligation）
1. 目前华大智造有2种序号的接头：1-128和501-596。关于其使用要求，请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外，华大智造申明：2种接头由于设计工艺不同，禁止混用，否则测序数据无法拆分！
2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。请按照表1和实际DNA投入量确实确定接头用量，需要稀释接头时，请用TE buffer对接头进行稀释。
表1 10ng-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度
|
Input DNA |
10μM Adapter稀释倍数 |
稀释后投入量（μL） |
|
31ng-1 μg |
不稀释 |
5 |
|
10-30 ng |
5 |
5 |
四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。
2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。
3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。
9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增（Library Amplification）
文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1 μg文库的推荐循环数。
表2 10 ng-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表
|
Input DNA（ng） |
Number of cycles required to generate |
|
1 μg |
|
|
1 μg |
3 - 5 |
|
500 ng |
4 - 6 |
|
200 ng |
5 - 7 |
|
50 ng |
8 - 10 |
|
10 ng |
10 - 12 |
【注】：建库过程中若进行片段分选，扩增时请参照较高循环数扩增。
六、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。
5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。
3. DNA Adapter：详情请咨询华大智造或本公司。
4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
图1 OnePot II DNA建库试剂盒操作流程
三、操作步骤
3.1DNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNAFragment/End Preparation/dA-Tailing）
该步骤将基因组DNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。
1. 将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表3反应体系。
表3 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系
|
名称 |
体积（μL） |
|
Input DNA |
x |
|
Smearase® Mix |
10 |
|
ddH2O |
Up to 60 μL |
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。
表4 DNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖105°C |
On |
|
4 °C |
1 min* |
|
30 °C |
3-20 min** |
|
72 °C |
20 min |
|
4 °C |
Hold |
【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表5；对于质量不一的FFPE DNA样本，酶切时间参考表6。
图2 Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值
3.2 接头连接（Adapter Ligation）
该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的MGI®接头。
1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。
|
名称 |
体积（μL） |
|
dA-tailed DNA（3.1步骤产物） |
60 |
|
Ligation Enhancer |
30* |
|
Fast T4 DNA Ligase |
5 |
|
DNA Adapter |
5 |
表7 Adapter Ligation PCR体系
【注】：*Ligation Enhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表8所示反应程序，进行接头连接反应。
表8 Adapter Ligation PCR反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖105°C |
Off |
|
20°C |
15 min |
|
4°C |
Hold |
【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。
3.3 连接产物磁珠纯化（Post Ligation Clean Up）
该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
3.3.1 纯化操作步骤：
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：
1）如产物无需进行片段分选，直接加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠
2）如产物需进行双轮分选，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。
3.3.2 双轮分选操作步骤：
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30 min。配制80%乙醇。
2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
3. 根据DNA片段长度要求，参考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。
表9 磁珠文库分选推荐比例
|
DNA文库插入片段大小 |
150 - 250 bp |
200-300 bp |
300-400 bp |
|
DNA文库大小 |
230 - 330 bp |
280-380bp |
380-480bp |
|
第一轮体积比（Beads:DNA） |
0.78× |
0.68× |
0.58× |
|
第二轮体积比（Beads:DNA） |
0.20× |
0.20× |
0.20× |
【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为200 bp，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.78×100 μL=78 μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL；表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用户在接头连接前进行分选，请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）说明书中推荐的比例。
4. 室温孵育5 min。
5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。
6. 参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。
7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。
8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
10. 重复步骤9。
11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。
12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中。
3.4 文库扩增（Library Amplification）
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2.于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。
表10 PCR扩增反应体系
|
名称 |
体积（μL） |
|
2×Ultima HF Amplification Mix |
25 |
|
Primer Mix for MGI |
5 |
|
Adapter Ligated DNA（3.3步骤产物） |
20 |
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11所示反应程序，进行PCR扩增。
表11 PCR扩增反应程序
|
温度 |
时间 |
循环数 |
|
98°C |
1 min |
1 |
|
98°C |
10 sec |
参照注意事项中表1 |
|
60°C |
30 sec |
|
|
72°C |
30 sec |
|
|
72°C |
5 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
3.5 扩增产物磁珠纯化或分选（Post Amplification Clean Up/Size Selection）
同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。
如需分选，操作方法同3.3.2双轮分选步骤。
3.6文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。
3.7 文库环化
使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®（Cat#13341）或其他等效产品进行文库单链环化反应。
3.8 参考实例
使用Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®对小牛胸腺gDNA样本进行酶切建库检测，片段化结果见图3；建库结果见图4。
图3 OnePot II DNA建库试剂盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA样本（不同酶切时间片段化效果检测）
图4 使用本试剂盒进行human gDNA样本建库，文库进行电泳检测
（Input DNA为50 ng，酶切12 min，扩增8 cycles）
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建库试剂盒 |
产品编号 |
规格 |
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24/96 T |
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24/96T |
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16×4/×16/×100 T |
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|
13363ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
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|
13364ES04/16/96 |
16×4/×16/×100 T |
|
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16×4/×16/×100 T |
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建库模块 |
产品编号 |
规格 |
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HB200415
