01 PCR产物的纯化是获得高质量模板的核心

Sanger测序是一个高度精确的技术，可以逐个碱基读出 DNA 序列，对模板的纯净度有着极高的要求。然而，PCR产物中的游离引物和核苷酸往往会干扰测序结果。如何在不损耗珍贵样本的前提下，获取干净、高质量的模板，是一个急需解决的难题。

图1.Sanger测序原理

 

在这种情况下，PCR产物的纯化成为了众多科研工作者的首选策略。传统的PCR纯化方法，如乙醇醋酸钠纯化、磁珠纯化或柱纯化，虽然有效，但往往耗时耗力，且在操作过程中容易损失样本。对于样本量有限的研究者来说，这无疑是一个相当棘手的问题。

翌圣生物提供的酶法PCR纯化法有着非常简单直接的工作流程，只有一个移液步骤。只需将核酸外切酶（Exonuclease I）和碱性磷酸酶加入PCR产物中，并在37℃静置15~30 min，即可完成纯化。这种方法不仅操作简便，而且大大减少了样本的损失，特别适合样本量有限的研究。

 

02 PCR酶法纯化是如何降解游离的引物和核苷酸，而不影响dsDNA目的产物

关键在于Exonuclease I！

Exonuclease I是一种对变性或单链脱氧核糖核酸具有高度选择性的核酸外切酶，作用时，Exonuclease I从引物（单链聚脱氧核糖核苷酸）的3 羟基端开始攻击，随后逐步释放出脱氧核糖核苷5 ' -单磷酸盐，但末端二核苷酸会保持完整。Exonuclease I对双链DNA或RNA无活性，因此不会降解目标产物dsDNA。接着，碱性磷酸酶将反应体系中的核苷酸去磷酸化，去磷酸化意味着反应体系中dNTP失去活性，从而不会影响测序反应。这是因为测序反应体系中的dNTP:ddNTP需要遵循特定比例，任何比例的偏差都可能引起不可预测的测序结果。（点击链接，获取更多Exonuclease I产品详情）

 

图2.Exonuclease I反应原理

03 PCR酶法纯化会影响后续的测序吗？

答案是：不会！

只需将反应混合物加热至80℃并保持15 min，即可使酶失活，得到干净的PCR扩增产物，直接用于测序反应。整个过程快速高效，无需额外的纯化步骤，也不会造成样本的损失。

 

翌圣PCR产物纯化解决方案

产品名称	产品货号	规格
Exonuclease I(20 U/μL)	14535ES	1000 U/5000 U
Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (1 U/µL)	10322ES	250 U