Vaccinia Capping System

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产品简介

 

真核生物中mRNA经转录后修饰可在5'端形成一个特殊结构,即帽子结构,该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶,其由D1和D12两个亚基组成,兼具RNA三磷酸酯酶活性(TPase)、鸟苷酰基转移酶活性(GTase)和鸟嘌呤甲基转移酶活性(N7 MTase)。牛痘病毒加帽酶参与作用下的mRNA加帽过程如下图1所示,在mRNA 5'端添加一个7-甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp),即为Cap0(图2)。

mRNA +1位核苷酸的核糖2’位羟基也可以甲基化,产物称为Cap1,人类的mRNA都具有Cap1结构。Cap1不仅与翻译起始有关,在针对外源RNA的先天免疫系统中,还可作为自身RNA的标志。2-O-甲基转移酶可以在mRNA +1位核苷酸的2´-OH位置处添加一个甲基基团,最终形成最有Cap1结构的mRNA(图3)。

该产品主要应用于RNA体外转录之后加帽,形成具有Cap1帽子结构的mRNA。

1 Cap0的形成过程

2 带有Cap0结构的mRNA

3 带有Cap1结构的mRNA

 

产品信息

 

货号

17121ES50 / 17121ES60 / 17121ES70

规格

50 T / 100 T / 500 T

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

17121ES50

17121ES60

17121ES70

17121-A

10×Capping Buffer

100μL

200μL

1000μL

17121-B

Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl)

50μL

100μL

500μL

17121-C

2-O-methyltransferase(50U/μl)

50μL

100μL

500μL

17121-D

RNase inhibitor(40U/μl)

25μL

50μL

250μL

17121-E

SAM(32mM)

12.5μL

25μL

125μL

17121-F

GTP(10mM)

50μL

100μL

500μL

17121-G

DEPC-H2O

2500μL

5000μL

25ml

用户需自备材料:转录后的RNA、RNA纯化试剂。

备注:RNA 可使用翌圣生物10623ES(T7 High Yield RNA Synthesis Kit)进行合成。

 

储存条件

 

-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

 

酶法加帽反应(以20μl 反应体系为例):

1) 10μg RNA用 DEPC-H2O 稀释至14 μL

2) 将 RNA 置于 65℃加热 5min,而后立即置于冰上 5min;

3) 依次加入以下各组分:

组分

体积(μL)

终浓度

Denatured RNA

10μg

0.5μg/μl

10×Capping Buffer

2

GTP(10mM)

1

0.5mM

SAM(32mM)

0.5

0.8mM

RNase inhibitor(40U/μl)

0.5

1U/μl

Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl)

1

0.5U/μl

2-O-methyltransferase(50U/μl)

1

2.5U/μl

37℃反应30min。

 

注意事项

 

  1. 加帽效率受RNA 5’端序列及结构影响,因此建议在加帽反应前,通过热变性的方法打开RNA的二级结构使RNA更容易加帽。一般热变性的操作条件为65℃、5min后立即置于冰浴,但可根据5’端序列、结构的复杂程度以及加帽体积适当延长热变性时间;
  2. 本试剂盒中SAM浓度为32mM,如加样体积过小,可在加帽反应前根据使用量将32mM储液用DEPC-H2O稀释成8mM或更低浓度的工作液;因SAM不稳定,稀释过程需在冰上操作,稀释量应等同于使用量;不建议将储液一次性稀释成低浓度的工作液;
  3. 如仅需要制备具有Cap0帽子结构的RNA,反应体系中可不添加2-O-methyltransferase;
  4. 加帽反应一般可在30min之内完成,可根据RNA 5’端序列、长度以及反应体积等调整时长。
  5. 本产品仅作科研用途
  6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

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Ver.CN20231130

400-6111-883