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产品简介
真核生物中mRNA经转录后修饰可在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性（TPase）、鸟苷酰基转移酶活性（GTase）和鸟嘌呤甲基转移酶活性（N7 MTase）。牛痘病毒加帽酶参与作用下的mRNA加帽过程如下图1所示，在mRNA 5'端添加一个7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp），即为Cap0（图2）。
mRNA +1位核苷酸的核糖2’位羟基也可以甲基化，产物称为Cap1，人类的mRNA都具有Cap1结构。Cap1不仅与翻译起始有关，在针对外源RNA的先天免疫系统中，还可作为自身RNA的标志。2-O-甲基转移酶可以在mRNA +1位核苷酸的2´-OH位置处添加一个甲基基团，最终形成最有Cap1结构的mRNA（图3）。
该产品主要应用于RNA体外转录之后加帽，形成具有Cap1帽子结构的mRNA。
图1 Cap0的形成过程
图2 带有Cap0结构的mRNA
图3 带有Cap1结构的mRNA
产品信息
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货号 |
17121ES50 / 17121ES60 / 17121ES70 |
|
规格 |
50 T / 100 T / 500 T |
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
17121ES50 |
17121ES60 |
17121ES70 |
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17121-A |
10×Capping Buffer |
100μL |
200μL |
1000μL |
|
17121-B |
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl) |
50μL |
100μL |
500μL |
|
17121-C |
2-O-methyltransferase(50U/μl) |
50μL |
100μL |
500μL |
|
17121-D |
RNase inhibitor(40U/μl) |
25μL |
50μL |
250μL |
|
17121-E |
SAM（32mM） |
12.5μL |
25μL |
125μL |
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17121-F |
GTP（10mM） |
50μL |
100μL |
500μL |
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17121-G |
DEPC-H2O |
2500μL |
5000μL |
25ml |
用户需自备材料：转录后的RNA、RNA纯化试剂。
备注：RNA 可使用翌圣生物10623ES（T7 High Yield RNA Synthesis Kit）进行合成。
储存条件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用说明
酶法加帽反应（以20μl 反应体系为例）:
1) 取10μg RNA用 DEPC-H2O 稀释至14 μL；
2) 将 RNA 置于 65℃加热 5min，而后立即置于冰上 5min；
3) 依次加入以下各组分：
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
Denatured RNA |
10μg |
0.5μg/μl |
|
10×Capping Buffer |
2 |
1× |
|
GTP(10mM) |
1 |
0.5mM |
|
SAM(32mM) |
0.5 |
0.8mM |
|
RNase inhibitor(40U/μl) |
0.5 |
1U/μl |
|
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl) |
1 |
0.5U/μl |
|
2-O-methyltransferase(50U/μl) |
1 |
2.5U/μl |
37℃反应30min。
注意事项
- 加帽效率受RNA 5’端序列及结构影响，因此建议在加帽反应前，通过热变性的方法打开RNA的二级结构使RNA更容易加帽。一般热变性的操作条件为65℃、5min后立即置于冰浴，但可根据5’端序列、结构的复杂程度以及加帽体积适当延长热变性时间；
- 本试剂盒中SAM浓度为32mM，如加样体积过小，可在加帽反应前根据使用量将32mM储液用DEPC-H2O稀释成8mM或更低浓度的工作液；因SAM不稳定，稀释过程需在冰上操作，稀释量应等同于使用量；不建议将储液一次性稀释成低浓度的工作液;
- 如仅需要制备具有Cap0帽子结构的RNA，反应体系中可不添加2-O-methyltransferase；
- 加帽反应一般可在30min之内完成，可根据RNA 5’端序列、长度以及反应体积等调整时长。
- 本产品仅作科研用途。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
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产品名称 |
货号 |
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