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Hifair® Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Kit是以RNA为模板进行多重定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。独特的Buffer设计，在体系中不包含影响冻干工艺的化学试剂，可用于一步法RT-qPCR冻干反应体系的配制和产品设计。
本试剂盒利用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并利用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。本试剂盒主要包含优化的冻干Buffer，Enzymes Mix等，缓冲液中已含有Mg2+和dNTP等，并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子，能够在保证引物扩增效率的同时，进行多重荧光定量扩增反应。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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13800ES60 (100 T) |
13800ES80 (1000 T) |
13800ES92 (10000 T) |
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13800-A |
4×Hifair® Lyo-Buffer |
625 μL |
6.25 mL |
62.5 mL |
|
13800-B |
Hifair® Lyo-Enzyme Mix |
100 μL |
1 mL |
10 mL |
|
13800-C |
DEPC-treated Water (DNase、RNase free) |
1.5 mL |
15 mL |
150 mL |
【注】1) 4×Hifair® Lyo-Buffer为Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Probe Buffer的简写。
- Hifair® Lyo-Enzyme Mix主要包含有耐热Hifair® V Reverse Transcriptase和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase。
适用机型
ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™，ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex，Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™，Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™，Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000，Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96，Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR
运输与保存方式
- 运输方式：冰袋运输。
- 保存方式：
Part 1： 13800-A【4×Hifair® Lyo-Buffer 】-20°C保存，有效期1年。
13800-C【DEPC-treated Water (DNase、RNase free)】-20°C保存，有效期1年。
Part 2： 13800-B【Hifair® Lyo-Enzyme Mix 】4°C保存，有效期6个月。
- 本品避免反复冻融。建议分装保存。
注意事项
1. 实验过程中请使用RNase free耗材。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
反应体系（以25 μL为例）
|
组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
4×Hifair® Lyo-Buffer |
6.25 |
1× |
|
Hifair® Lyo-Enzyme Mix |
1 |
- |
|
Primer Mix (10 μM) |
各0.4 |
0.16 μM |
|
Probe Mix (10 μM) |
各0.2 |
0.08 μM |
|
模板RNA |
1-5 |
- |
|
RNase Free H2O |
to 25 |
- |
【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度：Primer Mix中包含多对引物，通常每条引物终浓度可以根据情况在0.1-1.0 μM间进行调整。
b) 探针浓度：Probe Mix中包含多条不同荧光信号的探针，每条探针的浓度可根据具体情况在50-300 nM间调整。
c) 模板稀释：qPCR灵敏度极高，建议将模板进行稀释使用，控制Ct值在20-35之间适宜。
d) 反应体系：推荐使用25 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
标准扩增程序
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|
反应阶段 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
1 |
逆转录 |
50°Ca |
10 min |
1 |
|
2 |
预变性 |
95°C |
5 min |
1 |
|
3 |
扩增反应 |
95°C |
|
45 |
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60°Cb |
30 secc |
【注】：
a) 逆转录：42°C或者50°C均可，时间 10-15 min。
b) 扩增反应：扩增反应温度根据设计的引物Tm值进行调整。CDC官方推荐的ORF1ab和N引物，退火温度建议≥60°C。
c) 荧光信号采集：不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。
HB211220
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