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COA
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Hieff Unicon®Fast Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus)是以RNA为模板进行多重定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，本产品含有UDG酶，可有效防止气溶胶污染的风险。
本试剂盒利用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并利用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。本试剂盒主要包含优化的MP Buffer，Enzymes Mix等，缓冲液中已含有Mg2+和dNTP等，并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子，能够保证引物扩增效率的同时，进行多达四重的反应。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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13660ES60 (100 T) |
13660ES80 (1000 T) |
13660ES92 (10000 T) |
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13660-A |
4×HU® MP Buffer |
600 μL |
6 mL |
60 mL |
|
13660-B |
HU® Enzyme Mix (UDG plus) |
200 μL |
2×1 mL |
20 mL |
|
13660-C |
RNase Free H2O |
1.2 mL |
12 mL |
120 mL |
【注】
a. 4×HU® MP Buffer为Multiplex One Step RT-qPCR Probe Buffer的简写。本组分含有dNTP和dUTP
b. HU® Enzyme Mix主要包含有耐热Hifair® V Reverse Transcriptase、RNAse inhibitor、UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase和UDG酶。
运输和保存方法
冰袋运输。-20°C储存，有效期1年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
反应体系
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
4×HU® MP Buffer |
6 |
1× |
|
HU® Enzyme Mix (UDG plus) |
2 |
- |
|
Primer Mix (10 μM) |
1 |
0.4 μM |
|
Probe Mix (10 μM) |
0.5 |
0.2 μM |
|
模板RNA |
1-5 |
- |
|
RNase Free H2O |
to 25 |
- |
【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
a. 引物浓度：Primer Mix中包含多对引物，通常每条引物终浓度为0.4 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM间进行调整。
b. 探针浓度：Probe Mix中包含多条不同荧光信号的探针，每条探针的浓度可根据具体情况在50-300 nM间调整。
c. 模板稀释：qPCR灵敏度极高，建议将模板进行稀释使用，控制Ct值在20-35之间适宜。
d. 反应体系：推荐使用25 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e. 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
适用机型
需添加High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
需添加Low Rox 适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™
不需要Rox校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000
Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96
Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR
常规扩增程序
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
逆转录 |
50°Ca |
10 min |
1 |
|
预变性 |
95°C |
5 min |
1 |
|
扩增反应 |
95°C |
|
45 |
|
60°Cb |
30 secc |
快速扩增程序
|
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
逆转录 |
50℃ |
2 min |
1 |
|
预变性 |
95℃ |
2 sec |
1 |
|
扩增反应 |
95℃ |
|
42 |
|
60℃a |
13 secb |
【注】
a. 扩增反应：扩增反应温度根据设计的引物Tm值进行调整。
b. 荧光信号采集：不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。
注意事项
1. 实验过程中请使用RNase free耗材。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
HB221229
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