Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads (Anti-flag免疫磁珠)

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产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品简介

 

Anti-Flag免疫磁珠(Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads)是一种聚合物磁性微球,由高质量的鼠源DYKDDDDK (Flag) 单克隆抗体与粒径为200 nm的硅基磁珠通过价偶联制备,本产品具有快速的磁响应性,超顺磁性、良好的分散性、粒径均一、极低的非特异结合和丰富的结合位点等特点,可用于带有Flag标签的蛋白免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP)

Anti-Flag免疫磁珠(Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads)可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白(Met-FLAG–Protein),N端Flag融合蛋白(FLAG–Protein),C端Flag融合蛋白(Protein-FLAG)。

 

产品性质

 

基质(Matrix  spherical

硅基磁珠

配体(Ligand)

Anti-Flag Antibody

结合能力(Binding Capacity

≥0.6 mFlag标签融合蛋白/mL磁珠

径(Particle size)

200 nm

磁珠浓度Concentration

10 mg/mL

储存缓冲液(Storage Buffer)

PBS, 0.01% Tween-20, 0.02% NaN3

应用Application

IP、Co-IP等

 

储存条件

 

2~8℃保存,有效期1年。避免冻存!

 

使用说明

 

以免疫沉淀(IP)为例,步骤如下:

  1. 缓冲液配制

【注】建议以下缓冲液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。

裂解缓冲液:0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4WB/IP裂解液(Cat#20118ES)

平衡/结合/洗杂缓冲液:0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0

洗脱缓冲液:0.1 M甘氨酸,pH 3.0

中和缓冲液:1 M Tris-HCl,pH 8.5

  1. 样品准备

本操作说明书提供以下种样品处理方法,建议您根据不同来源的样品选择适当的方式进行预处理,使待检测蛋白释放至样品溶液中。

血清样品处理:若目标蛋白丰度较高, 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理:离心收集细胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解液在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

贴壁细胞样品处理:移去培养基,用PBS清洗细胞遍;用细胞刮棒刮脱细胞,收集至1.5mL EP管内按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解液在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

  1. 磁珠预处理

3.1用移液器轻柔吹打Anti-Flag免疫磁珠,使其充分混悬,取25~50 µL 磁珠悬液置于1.5 mL离心管中。

3.2加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer并轻轻移液器混合,用移液器轻柔吹打重悬Anti-Flag免疫磁珠,放置在磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸弃上清。重复洗2次。

4. 样品的结合

4.1在预处理后的磁珠中加入含有Flag标签的蛋白样品,置于翻转混合仪上孵育(常温1~2 h,4℃过夜);

4.2将上述混合液置于磁力架上静置大约1 min待溶液变澄清后,把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测Flag标签蛋白是否存在残留),原离心管中剩余的即为蛋白-磁珠复合物;

注意:结合过程中,磁珠可能会出现聚团或呈片状,属于正常现象,不会影响实验结果。

5. 洗涤

5.1上述步骤4.2所得的蛋白-磁珠复合物中加入1000 µL IP Lysis/Wash Buffer,轻柔混匀磁珠5~10 min,接着在磁力架上静置大约1 min待溶液变澄清后, 吸弃上清;

5.2重复步骤5.1两次,直至洗涤后的上清液OD280小于0.05为止;

注意:如上清液的OD280仍大于0.05,则适当增加洗涤次数。

  1. 蛋白洗脱

根据下游用途选择洗脱方法。

6.1 Flag融合蛋白洗脱

1)配制Flag多肽洗脱液:TBS中溶解Flag多肽,终浓度为0.2-1 mg/mL。

2)分别加入100 μL Flag多肽洗脱液,4℃孵育 2 h-6 h(慢慢摇晃)

3)分离磁珠上的磁珠并保存含有目标抗原的上清液。

4)重复洗脱步骤一次以获得更高的回收率

6.2 酸性洗脱(0.1 M Gly-HCl,pH 3.0)

1)加入100 μL 0.1 M Gly-HCl,pH 3.0,室温孵育5-10 min(慢慢摇晃)。

2)分离磁珠上的磁珠并保存含有目标抗原的上清液。

3)中和低pH,每100 μL洗脱液加入20 μL中和缓冲液(1 M Tris-HCl,pH 8.5)。

6.3 用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱

如需直接检测目的蛋白,则在上述洗涤过的蛋白-磁珠复合物中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸 10 min,冷却至室温并在磁力架上分离磁珠,取上清进行 SDS-PAGE 检测。

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20240801

400-6111-883