产品简介

 

Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）是一种聚合物磁性微球，由高质量的鼠源抗DYKDDDDK (Flag) 单克隆抗体与粒径为200 nm的硅基磁珠通过共价偶联制备，本产品具有快速的磁响应性，超顺磁性、良好的分散性、粒径均一、极低的非特异结合和丰富的结合位点等特点，可用于带有Flag标签的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。

 

产品性质

 

基质（Matrix  spherical）	硅基磁珠
配体（Ligand）	Anti-Flag Antibody
结合能力（Binding Capacity）	≥0.6 mg Flag标签融合蛋白/mL磁珠
粒径（Particle size）	200 nm
磁珠浓度（Concentration）	10 mg/mL
储存缓冲液（Storage Buffer）	PBS, 0.01% Tween-20, 0.02% NaN3
应用（Application）	IP、Co-IP等

 

储存条件

 

2~8℃保存，有效期1年。避免冻存！

 

使用说明

 

以免疫沉淀（IP）为例，步骤如下：

1. 缓冲液配制

【注】建议以下缓冲液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。

裂解缓冲液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液（Cat#20118ES）

平衡/结合/洗杂缓冲液：0.15 M NaCl, 20 mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

2. 样品准备

本操作说明书提供以下三种样品处理方法，建议您根据不同来源的样品选择适当的方式进行预处理，使待检测蛋白释放至样品溶液中。

血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM）。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

贴壁细胞样品处理：移去培养基，用PBS清洗细胞两遍；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM）。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

3. 磁珠预处理

3.1用移液器轻柔吹打Anti-Flag免疫磁珠，使其充分混悬，取25~50 µL 磁珠悬液置于1.5 mL离心管中。

3.2加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer并轻轻移液器混合，用移液器轻柔吹打重悬Anti-Flag免疫磁珠，放置在磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清。重复洗2次。

4. 样品的结合

4.1在预处理后的磁珠中加入含有Flag标签的蛋白样品，置于翻转混合仪上孵育(常温1~2 h，或4℃过夜)；

4.2将上述混合液置于磁力架上静置，大约1 min，待溶液变澄清后，把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测Flag标签蛋白是否存在残留)，原离心管中剩余的即为蛋白-磁珠复合物；

注意：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果。

5. 洗涤

5.1向上述步骤4.2所得的蛋白-磁珠复合物中加入1000 µL IP Lysis/Wash Buffer，轻柔混匀磁珠5~10 min，接着在磁力架上静置，大约1 min，待溶液变澄清后后, 吸弃上清；

5.2重复步骤5.1两次，直至洗涤后的上清液OD280小于0.05为止；

注意：如上清液的OD280仍大于0.05，则适当增加洗涤次数。

6. 蛋白洗脱

根据下游用途选择洗脱方法。

6.1 Flag融合蛋白洗脱

1）配制Flag多肽洗脱液：TBS中溶解Flag多肽，终浓度为0.2-1 mg/mL。

2）分别加入100 μL Flag多肽洗脱液，4℃孵育 2 h-6 h（慢慢摇晃）

3）分离磁珠上的磁珠并保存含有目标抗原的上清液。

4）重复洗脱步骤一次以获得更高的回收率

6.2 酸性洗脱（0.1 M Gly-HCl，pH 3.0）

1）加入100 μL 0.1 M Gly-HCl，pH 3.0，室温孵育5-10 min（慢慢摇晃）。

2）分离磁珠上的磁珠并保存含有目标抗原的上清液。

3）中和低pH，每100 μL洗脱液加入20 μL中和缓冲液(1 M Tris-HCl，pH 8.5)。

6.3 用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱

如需直接检测目的蛋白，则在上述洗涤过的蛋白-磁珠复合物中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸 10 min，冷却至室温并在磁力架上分离磁珠，取上清进行 SDS-PAGE 检测。

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20240801