泛素化是通过三个酶促步骤实现的。在ATP依赖的过程中,泛素激活酶(E1)催化与泛素形成活性硫酯键,然后转移到泛素载体蛋白的活性位点半胱氨酸(E2)。泛素级联对特定底物蛋白的选择性依赖于E2结合酶(细胞中包含的相对较少)和泛素-蛋白连接酶(E3)之间的相互作用,迄今为止已经鉴定出600多种这种酶。E3s是一个大的,多样化的蛋白质组,其特征是几个确定的基序之一。这些包括HECT(与e6相关蛋白c端同源),RING(真正有趣的新基因)或U-box(没有Zn2+结合配体的完整补充的修饰的RING基序)结构域。而HECT E3s在泛素化过程中具有直接的催化作用,RING和U-box E3s促进蛋白质泛素化。 后两种E3类型充当适配器类分子。 它们使E2和底物足够接近,从而促进底物的泛素化。虽然许多RING-type e3,如MDM2和c-Cbl,可以单独发挥作用,但其他一些是作为更大的多蛋白复合体的组成部分,如后期促进复合体。综上所述,这些多面的特性和相互作用使E3s能够利用泛素-蛋白酶体系统,在真核生物的所有细胞中提供一种强大而具体的蛋白质清除机制。该筛选试剂盒集合了11种常用E2结合酶,可以筛选具有E3连接酶活性的蛋白所匹配的E2酶。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 规格 |
---|---|---|
20440-A | 10× Reaction Buffer | 200 μL |
20440-B | 10× E1 Enzyme | 200 μL |
20440-C | 5× Ubiquitin(冻干粉中加400 μL水) | 400 μL |
20440-D | 10× Mg2+-ATP | 200 μL |
20440-E | 10× E3 Ligase Itch (Positive control) | 20 μL |
20440-F | 20× S5a substrate (Positivecontrol) | 20 μL |
20440-G | 20× UBE2R1/UbcH3/Cdc34 (2R1) | 15 μL |
20440-H | 20× UBE2N/UBE2V2 Complex (2N/2V2) | 15 μL |
20440-I | 20× UBE2D1/UbcH5a (D1) | 15 μL |
20440-J | 20× UBE2D2/UbcH5b (D2) | 15 μL |
20440-K | 20× UBE2D3/UbcH5c (D3) | 15 μL |
20440-L | 20× UBE2L3/UbcH7 (2L3) | 15 μL |
20440-M | 20× UBE2K/E2-25K (2K) | 15 μL |
20440-N | 20× UBE2C/UbcH10 (2C) | 15 μL |
20440-O | 20× UBE2H/UbcH2 (2H) | 15 μL |
20440-P | 20× UBE2L6/UbcH8 (2L6) | 15 μL |
20440-Q | 20× UBE2E1/UbcH6 (E1) | 15 μL |
阳性对照反应体系
组分 | 体积(μL) |
---|---|
ddH2O | to 20 μL |
10× Reaction Buffer | 2 μL |
10× E1 Enzyme | 2 μL |
5×Ubiquitin | 4 μL |
10× ATP-Mg | 2 μL |
20× E2 Enzyme | 1 μL |
10× E3 Ligase Itch (Positive control) | 2 μL |
20× S5a substrate (Positive control) | 1 μL |
*使用者自己准备,E3Ubiquitin Ligase 可重组表达或从细胞裂解液中纯化,Substrate(可选) not required for analyzing E3 Auto-Ubiquitination.
反应条件
37℃孵育(30min-2h,如果效果不明显可增加反应时间12h),建议使用PCR仪或金属浴。
结果检测
1.取样品20 μL加入5μL的5×SDS-PAGEBuffer(加入1μL新鲜配制的1MDTT),加热样品95℃ 5min,随后使用还原性(含DTT)上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳分析;
2.选择E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate 抗体进行 Western-blot 分析。
-20℃至-80℃保存,1 年有效期。建议第一次使用时分装冻存,避免反复冻融。
Q:试剂盒的20440-C Ubiquitin带标签吗?
A:不带。
Q:植物样本可以用这个试剂盒做泛素结合酶筛选吗?
A:可以的。试剂盒本身没有物种限制。
Q:试剂盒中的阳性对照反应体系的E2 Enzyme指的是哪个组分呢?
A:20440-I UBE2D1/UbcH5a (D1)、20440-J UBE2D2/UbcH5b (D2)或者20440-K UBE2D3/UbcH5c (D3)。
Q:试剂盒组分用原液吗?还是稀释液?
A:需要用原液,不能稀释,稀释可能导致蛋白酶降解。
Q:阳性体系里的E3浓度是多少?
A:0.2-2 μM.
Q:阳性体系里的底物浓度是多少?
A:1-5 μM.