泛素化是通过三个酶促步骤实现的。在ATP依赖的过程中，泛素激活酶(E1)催化与泛素形成活性硫酯键，然后转移到泛素载体蛋白的活性位点半胱氨酸(E2)。泛素级联对特定底物蛋白的选择性依赖于E2结合酶(细胞中包含的相对较少)和泛素-蛋白连接酶(E3s)之间的相互作用，迄今为止已经鉴定出600多种这种酶。E3s是一个大的，多样化的蛋白质组，其特征是几个确定的基序之一。这些包括HECT(与e6相关蛋白c端同源)，RING或U-box(没有Zn2+结合配体的完整补充的修饰的RING基序)结构域。而HECT E3s在泛素化过程中具有直接的催化作用，RING和U-box E3s促进蛋白质泛素化。后两种E3类型充当适配器类分子。它们使E2和底物足够接近，从而促进底物的泛素化。虽然许多RING-type e3，如MDM2和c-Cbl，可以单独发挥作用，但其他一些是作为更大的多蛋白复合体的组成部分，如后期促进复合体。综上所述，这些多面的特性和相互作用使E3s能够利用泛素-蛋白酶体系统，在真核生物的所有细胞中提供一种强大而具体的蛋白质清除机制。E3s的重要性突出体现在其调节的正常细胞过程的数量，以及与其功能丧失或靶向不当相关的疾病的数量。

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