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产品简介
泛素化是通过三个酶促步骤实现的。在ATP依赖的过程中，泛素激活酶(E1)催化与泛素形成活性硫酯键，然后转移到泛素载体蛋白的活性位点半胱氨酸(E2)。泛素级联对特定底物蛋白的选择性依赖于E2结合酶(细胞中包含的相对较少)和泛素-蛋白连接酶(E3s)之间的相互作用，迄今为止已经鉴定出600多种这种酶。E3s是一个大的，多样化的蛋白质组，其特征是几个确定的基序之一。这些包括HECT(与e6相关蛋白c端同源)，RING或U-box(没有Zn2+结合配体的完整补充的修饰的RING基序)结构域。而HECT E3s在泛素化过程中具有直接的催化作用，RING和U-box E3s促进蛋白质泛素化。后两种E3类型充当适配器类分子。它们使E2和底物足够接近，从而促进底物的泛素化。虽然许多RING-type e3，如MDM2和c-Cbl，可以单独发挥作用，但其他一些是作为更大的多蛋白复合体的组成部分，如后期促进复合体。综上所述，这些多面的特性和相互作用使E3s能够利用泛素-蛋白酶体系统，在真核生物的所有细胞中提供一种强大而具体的蛋白质清除机制。E3s的重要性突出体现在其调节的正常细胞过程的数量，以及与其功能丧失或靶向不当相关的疾病的数量.
产品性质
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来源(Source) |
E.coli |
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分子量 (Molecular Weight) |
E3酶大约102kDa,底物蛋白大约40.7kDa. |
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外观 |
Liquid |
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标签(Tag) |
None |
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纯度(Purity) |
> 95% by SDS-PAG |
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缓冲液(Buffer) |
(25 µM) in 50 mM HEPES （pH 7.5）, 200 mM NaCl, 10% Glycerol. |
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浓度（Concentration） |
具体见管外标签 |
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
规格 |
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20439-A |
重组人泛素连接酶E3 |
20 μL |
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20439-B |
修饰底物蛋白 |
20 μL |
反应缓冲液配方
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名称 |
组分 |
浓度 |
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10 × Reaction Buffer（200 μL） |
Tris PH8.0 |
500 mM |
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DTT |
6 mM |
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ddH2O |
to 200 μL |
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10 x ATP-Mg （200 μL）
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ATP |
100 mM |
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MgCl2 |
100 mM |
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ddH2O |
to 200 μL |
参考阳性反应体系
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组分 |
体积 (μL) |
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ddH2O |
to 20 μL |
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10 × Reaction Buffer |
2 μL |
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10 × E1 Enzyme |
2 μL |
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5 × Ubiquitin |
4 μL |
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10 × ATP-Mg |
2 μL |
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20 × E2 Enzyme |
1 μL |
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10 × E3 Ligase Itch (Positive control) |
2 μL |
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20 × 底物修饰蛋白 (Positive control) |
1 μL |
反应条件
37℃孵育（30 min-120min，如果效果不明显可增加反应时间12 h），建议使用PCR仪或金属浴。
结果检测
- 取样品20 μL加入5 μL的5× SDS-PAGE Buffer加入1 μL（1M DTT新鲜配制），加热样品95℃ 5 min，随后使用还原性（含DTT）上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳分析;
- 选择E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate抗体进行Western-blot分析。
储存条件
-25~-15℃保存，建议第一次使用时分装冻存。
注意事项
1. 避免反复冻融。
2. 本产品仅作科研用途。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20241203
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