产品简介

 

Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)植物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强。试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至1 mm植物叶片即可进行实验。

本试剂盒中提供的2× Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。

 

组分信息

 

类别	组分编号	组分名称	10187ES05	10187ES50	10187ES70
Part I	10187-A	Buffer P1	250 μL	1.25 mL × 2	5 mL × 2
	10187-B	Buffer P2	50 μL	500 μL	1 mL × 2
Part II	10187-C	2 × Plant Master Mix*	50 μL	500 μL	1 mL × 2

*2× Plant Master Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等，同时包含电泳Loading Buffer，PCR完成之后可直接电泳。

 

储存条件

 

1. 试剂10187-A【Buffer P1】，置于2-8℃保存。有效期1年。

2. 试剂10187-B【Buffer P2】，中和裂解产物，利于更长时间保存样本，置于2-8℃保存。有效期1年。

3. 试剂10187-C【2 × Plant Master Mix】，-25~-15℃保存，避免反复冻融。有效期1年。

 

使用说明

1. 植物叶片

1. 1、研磨裂解法：

a. 研磨仪破碎：将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中，用研磨仪加钢珠（钢珠直径3mm左右，共2个）破碎叶片（45 Hz，1 min），叶片破碎后溶液呈现绿色，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL用于PCR扩增。

b. 枪头捣碎：推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中，用枪头将叶片捣碎，捣碎后溶液呈现绿色，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL用于PCR扩增。

2. 1、加热裂解法：推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中，95℃加热5-10 min（确保裂解液完全浸没叶片），较难裂解的叶片（老叶片）可适当延长时间（10-20 min），加热裂解后溶液呈现绿色，震荡混匀，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL用于PCR扩增。
3. 1、直接法：推荐使用幼嫩叶片。使用打孔器或者刀，将直径1 mm左右的叶片直接加入到PCR反应体系中；复杂样本或者是长片段的扩增，推荐使用直径<1 mm的叶片。

2. PCR反应体系

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
2× Plant Master Mix	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
裂解产物（DNA模板）	1	2	-
ddH2O	To 20	To 50	-

表1 反应体系

【注】：各组分使用前应充分混匀。

1. 模板加入量：小于PCR反应体系的5%，过多会严重抑制PCR反应，强烈推荐加入1 μL模板。叶片直扩优先推荐研磨仪裂解法。
2. 引物终浓度：0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。
3. 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
4. 体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
5. 对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
6. 为了更稳定的保存裂解后的模板，将转移出来的上清液，按照裂解产物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合，混匀后-20℃保存，稳定保存随时间和样本状态不同而有所不同。如果处理后的植物叶片上清液一周内用于PCR扩增，不用加Buffer P2，上清液请保存在-20℃。

3. 反应条件

循环步骤	温度 (°C)	时间	循环数
预变性	94	5 min	1
变性	94	10 sec	35
退火	50-65	20 sec
延伸	72	1 min/kb
终延伸	72	5 min	1
表2 反应条件

【注】：

1. 退火温度：请参考引物的理论 Tm 值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。
2. 延伸时间：需要根据片段的长度来确定，对于1 kb以内的DNA片段，建议延长时间为1 min。

 

注意事项

 

1. 做叶片实验时，建议使用新鲜采取的叶片组织，若为长期冷冻组织，需-80℃保存，应尽量避免反复冻融，以免造成模板降解，影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜，若为成熟的叶片，避免使用叶片主脉部位组织。
2. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。
3. 取样时使用打孔器或者刀取适宜大小的样本，样本不同时，打孔器或者刀每次处理样本前需清洗干净。
4. 对于叶片组织，建议取1-10 mm的叶片，过小会使PCR扩增产量低，过多会抑制PCR反应，采用加热裂解法、枪头捣碎、研磨仪破碎的方式处理植物叶片，处理后需震荡离心，务必取上清液试验，沉淀会严重抑制PCR反应。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
6. 本产品仅作科研用途！

 

常见问题与解决方法

 

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱	裂解液、中和液加入比例不当，裂解混合液影响PCR体系的pH值。	正常条件下，中和后的裂解混合液的pH应该在7-8左右（裂解产物和Buffer P2严格按照5:1的量进行中和）。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存5天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系<5%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐35-40循环为佳。因模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

 

Ver. CN20231102