产品简介

 

动物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同动物组织进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强、操作简易。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA，如昆虫足翅、鼠尾、鼠趾、动物皮肤和内脏等。裂解产物可以用于DNA提取纯化、也可以直接用于PCR反应、也可以在-20℃或以下温度条件下长期保存备用。

本试剂盒中提供的2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)具有很强的扩增兼容性，不需要额外采用纯化提取试剂去除裂解产物中的各种残骸杂质，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化扩增步骤的操作过程，降低污染机率。

该试剂盒可用于动物基因扩增检测、转基因动物基因型鉴定等。

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	10184ES50	10184ES70	储存条件
10184-A	Lysis Buffer	10 mL	4×10 mL	2-8℃
10184-B	Proteases	100 μL	400 μL	-25~-15℃
10184-C	2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)	500 μL	1×2 mL	-25~-15℃
10184-D	5×PCR Enhancer	200 μL	800 μL	-25~-15℃

a）Lysis Buffer和 Proteases两种组分配合使用于动物组织裂解。

b）2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)包含PCR扩增所需要的热启动Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺等；已混有溴酚蓝染料作为电泳指示剂，PCR产物可以直接进行电泳。

c）5×PCR Enhancer：高GC含量扩增（如大于65%）时，建议使用5×PCR Enhancer。

 

储存条件

 

1. 试剂10184-A【Lysis Buffer】为动物组织裂解缓冲液，建议保存于2-8℃。

2. 试剂10184-B【Proteases】为动物组织裂解剂，使用时请勿长久开盖，建议保存于-25~-15℃，避免反复冻融。

3. 试剂10184-C【2×Tissue Direct PCR Mix (With Dye)】，建议保存于-25~-15℃，避免反复冻融。

4. 试剂10184-D【5×PCR Enhancer】，建议保存于-25~-15℃，避免反复冻融。

试剂盒有效期1年。

 

使用说明

 

1. 在离心管中加入200 μL Lysis Buffer和2 μL Proteases，轻轻涡旋混匀。
2. 取约10 mg（长度2 mm左右）动物组织，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。
3. 55℃孵育5-30 min，然后95℃处理5 min。
4. 12,000 rpm离心2 min。
5. 将上清转移至新的离心管，-20℃保存或直接用于PCR扩增。

【注】

a）Lysis Buffer与Proteases混合后尽快使用，不宜长期保存；大量样本操作时，可以将Lysis Buffer与Proteases按100 μL:1 μL的比例混匀备用。

b）组织应取少量并尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。各组织推荐使用量：鼠尾：长度2-4 mm；鼠趾：1-4个；鼠脏器、脑：直径2-4 mm；斑马鱼、线虫、果蝇等昆虫组织：1-4个；细胞数量:10⁵-10⁸个。斑马鱼、线虫、果蝇等较小样本的组织，可适当减少Lysis Buffer至50-100 μL。昆虫等外壳坚硬的样本，建议剪碎样本并增加Proteases至4 μL。

c）55℃孵育，一般5 min即可满足多数PCR需求，如鼠尾、鼠耳等组织；若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至30 min或更久；裂解时间可在5-30 min之间调整，组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

6. 推荐PCR反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
2×Tissue Direct PCR Mix（With Dye）	10	1×
Forward Primer（10 μM）	0.5	0.25 μM
Reverse Primer（10 μM）	0.5	0.25 μM
裂解产物（DNA模板）	2	-
无菌超纯水	To 20	-

表1 PCR反应体系

【注】：各组分使用前应充分混匀。

a）模板使用量：建议总体系的5-20%之间，避免超过总体系的20%。

b）引物终浓度：反应性能较差时，推荐在0.1- 0.5 μM范围内调整引物浓度。

c）反应体系：推荐使用20 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

e）对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

7. 反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	10 sec	35
退火*	60℃	20 sec
延伸**	72℃	20 sec
终延伸	72℃	5 min	1

表2 PCR反应程序

*退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值5℃，或通过梯度PCR确定最佳温度。

 

注意事项

 

1. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3. 本产品仅作科研用途！

 

常见问题与解决方法

 

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2×PCR Mix应保存于-25~-15℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在2-8℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液可在2-8℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系5-20%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	提高PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

 

Ver.CN20241029