产品简介

 

本试剂盒可直接快速地对小鼠组织（如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等）样本进行PCR扩增，具有极强的样本兼容性。本试剂盒配备了强力的裂解缓冲液，可以快速裂解样品，释放基因组DNA。裂解液可以直接加入到PCR反应体系中，无需精提纯化，操作方便。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，5 mg小鼠组织或1-5 mm鼠尾即可进行实验。

本试剂盒提供的2× Mouse Direct PCR Mix为2倍浓度的热启动PCR反应液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。且含有示踪染料，PCR产物可直接电泳。

该试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	10185ES50	10185ES70	储存条件
10185-A	Buffer ML	1×5 mL	20×1 mL	2-8℃
10185-B	Buffer MT	0.6 mL	1.25×2 mL	-25~-15℃
10185-C	2× Mouse Direct PCR Mix	500 μL	1×2 mL	-25~-15℃

a) Buffer ML为裂解缓冲液，包含强力蛋白变性剂，请戴手套操作。

b) Buffer MT为终止缓冲液，用于终止Buffer ML的裂解功能。

c) 2× Mouse Direct PCR Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂和电泳指示染料等。

 

储存条件

 

1. 试剂10185-A【Buffer ML】，2-8℃保存。如长时间未使用，请分装冻存，避免交叉污染。

2. 试剂10185-B【Buffer MT】，-25~-15℃保存，避免反复冻融。

3. 试剂10185-C【2× Mouse Direct PCR Mix】，-25~-15℃保存，避免反复冻融。

试剂盒有效期1年。

 

使用说明

 

样品基因组DNA释放

1. 剪取5-10 mg动物组织或1-5 mm鼠尾，置于1.5 mL离心管中；
2. 在上述离心管中加入90 μL Buffer ML，轻轻涡旋使得样品完全被裂解液浸润，短暂离心；
3. 在恒温孵育仪中设置95℃孵育15 min；
4. 加入10 μL Buffer MT，轻弹混匀，终止裂解;
5. 选做步骤：12,000 rpm离心2 min；
6. 将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接取上清用于后续PCR扩增。

*组织应尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。

**95℃孵育，一般15 min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至30 min。组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

PCR反应鉴定——PCR反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
2× Mouse Direct PCR Mix	10	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	0.2-0.4 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	0.2-0.4 μM
裂解产物（DNA模板）	1	-
无菌超纯水	To 20	-

表1 PCR反应体系

【注】：各组分使用前应充分混匀。

a）模板使用量：建议按1-10%总体系量取用模板，20 μL体系建议采用1 μL上清液作为模板；

b）引物终浓度：0.2-0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度；

c）反应体系：推荐使用20 μL，也可根据使用习惯调整体系体积大小；

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

PCR反应鉴定——PCR反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	10 sec	35***
退火*	60℃	20 sec
延伸**	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

表2 PCR反应程序

*退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值2-5℃，或通过梯度PCR确定最佳温度。

**延伸时间：请按30 sec/kb设定。

***扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。

电泳上样：取3-5 μL扩增产物上样即可。

对照反应：在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

 

注意事项

 

1. 为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中，反复洗刷数次进行清洗，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。
2. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
3. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5. 本产品仅作科研用途！

 

常见问题与解决方法

 

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2×PCR Mix应保存于-25~-15℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在2-8℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液可在2-8℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系1-10%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	提高PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

 

 

Ver.CN20250304