蛋白质提取实验中会用到哪些酶类，各自的作用是什么 一文看懂“破壁酶＋去核酸酶”的分工与选型

溶菌酶是细菌蛋白提取中最经典的破壁酶。它通过水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸（NAM）与N-乙酰葡糖胺（NAG）之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁降解破裂、内容物释放。肽聚糖层厚实的革兰氏阳性菌对溶菌酶高度敏感；革兰氏阴性菌外层还有一层外膜，通常需要EDTA或去污剂配合才能充分暴露肽聚糖层。

实践中有两类溶菌酶常用：从鸡蛋清提取的天然溶菌酶和重组表达的高活性溶菌酶，如重组T4溶菌酶——它由T4噬菌体基因E编码的胞壁质水解酶重组表达而来，活性可达鸡蛋清溶菌酶的数百倍，用量小、裂解快，且无动物源成分、无RNase/DNase残留，提取物可直接用于SDS-PAGE、WB、活性测定与亲和纯化，适合大肠杆菌可溶性蛋白与膜蛋白提取。

酵母、真菌的细胞壁不含肽聚糖，溶菌酶对其无效，需要改用β-1,3-葡聚糖酶类。溶壁酶（Lyticase，又称Zymolyase）通过水解细胞壁β-1,3-葡聚糖骨架，配合渗透压缓冲液即可温和制备原生质体、释放胞内蛋白，是酿酒酵母、毕赤酵母等真核微生物蛋白提取的常用工具。蜗牛酶（Snailase）则取自蜗牛消化液，是纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、β-葡聚糖酶等多种酶的复合物，广谱适用于酵母及丝状真菌。

植物细胞壁以纤维素为主，胞间层富含果胶。纤维素酶水解纤维素的β-1,4糖苷键，果胶酶降解果胶，二者配合可在研磨、匀浆基础上进一步瓦解细胞壁结构，显著提高叶片、果实、种子等植物样本的蛋白释放效率。

动物组织蛋白提取前常需将组织块解离为细胞悬液。胶原酶能特异降解细胞间质中的胶原纤维，温和消化结缔组织；胰蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶，特异性切割赖氨酸（Lys）与精氨酸（Arg）羧基端的肽键，常用于贴壁细胞与组织的解离。注意：胰蛋白酶本身也能降解目标蛋白，须严格控制消化时间与浓度，并及时加入蛋白酶抑制剂终止反应。

全能核酸酶源自粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），经基因工程改造为非特异性核酸内切酶，可在任意核苷酸位点切割，将双链、单链、线性、环状等各种形式的DNA和RNA彻底消化为3～5个碱基的5'-单磷酸寡核苷酸。它是降低裂解液黏度、去除核酸污染的首选：加入微量即可使黏稠的裂解物快速“液化”，离心澄清度显著提升、层析流速加快，并消除核酸对2D电泳、IP、WB的干扰。该酶兼容6 M尿素、0.1% SDS、1 mM EDTA等严苛条件，反应依赖Mg²⁺，另有GMP级及耐高盐版本可选。

DNase I是依赖Ca²⁺/Mg²⁺的内切酶，可将单链、双链DNA水解为含5'-磷酸末端的寡核苷酸。当机械破碎（超声、匀浆）后DNA碎片化不充分时，加入DNase I可进一步降解DNA、降低黏度，消除其对蛋白定量与电泳的干扰。DNase I有牛胰腺来源与重组（RNase-free）来源两种：前者经济，后者无RNase残留，适合对RNase敏感的样品。

RNase A是一种极为稳定的内切核糖核酸酶，特异性切割嘧啶核苷酸3'端磷酸二酯键，在高温（100 ℃，15 min）下仍保持活性，因此可在“煮沸灭活DNase”的操作中“幸存”，单独用于去除蛋白样品中的RNA污染。选择时应优先使用经质检确认无DNase残留的产品。

蛋白酶K是源自林伯氏白色念球菌（Tritirachium album）的广谱丝氨酸蛋白酶，可切割脂肪族与芳香族氨基酸羧基端的肽键，且在1% SDS、尿素等变性剂中活性反而增强。在蛋白质研究中，蛋白酶K多用于“反向”场景——如去除样品中的杂蛋白、宿主核酸酶或内毒素相关蛋白，为后续分析提供干净的底物。需要说明：当目标是提取并保留特定蛋白时，应改用蛋白酶抑制剂保护蛋白，而非使用蛋白酶K。

细胞裂解后释放的大量内源性蛋白酶（丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、氨肽酶、酸性蛋白酶等）是目标蛋白的最大威胁。蛋白酶抑制剂Cocktail是多种抑制剂的混合物，如AEBSF、Aprotinin、Bestatin、E-64、Leupeptin、Pepstatin A等，可广谱抑制各类蛋白酶；选择EDTA-free版本可避免螯合金属离子，兼容IMAC镍柱纯化与天然蛋白活性研究，研究磷酸化蛋白时再配合磷酸酶抑制剂。严格来说蛋白酶抑制剂并非“酶类”，但它是完整酶法方案中不可或缺的一环——“破壁酶负责释放、核酸酶负责清理、抑制剂负责守护”。

表1 蛋白质提取常用酶类速查

蛋白提取的酶类选型并不复杂：先看样本来源选择破壁酶，再按下游需求搭配核酸酶，最后务必加入蛋白酶抑制剂。翌圣生物科技（上海）股份有限公司提供从破壁酶、核酸酶到蛋白酶抑制剂的一站式产品组合，助力获得“高得率、高纯度、高活性”的蛋白样品。

表2 翌圣生物蛋白提取相关酶类产品推荐