随着 mRNA 疫苗实现产业化落地，核酸药物研发迎来全新发展阶段。传统线性 mRNA 存在易被核酸酶降解、体内蛋白表达周期短、需高价修饰核苷、免疫原性不可控等短板，限制长效治疗场景应用。环状 RNA（circRNA）凭借独特共价闭合结构脱颖而出，成为疫苗、基因治疗领域新一代热门研发载体，国内多款 circRNA 候选药物已推进至 IND 阶段。

对比线性 mRNA，circRNA 无需高价修饰核苷，给药周期更长、生产成本更低，但完整制备链路包括质粒模板构建、体外转录（IVT）、RNA 末端修饰、酶促环化，长期存在三大核心工艺痛点，直接制约实验与产业化进度：

• 载体自连背景严重：质粒单 / 双酶切线性化后，DNA 5’端留存磷酸基团，连接阶段大量空载载体自发环化，阳性克隆占比极低，筛选工作量成倍增加，难以获取足量合格模板；
• IVT 杂质抑制环化反应：体外转录体系残留游离 dNTP，同时新生线性 RNA 携带 5’三磷酸末端，竞争性抑制 T4 RNA 连接酶环化活性，最终产物中线性副产物占比偏高；
• 传统碱性磷酸酶操作繁琐，RNA 损耗严重：CIAP 需苯酚抽提灭活，极易破坏 RNA 完整性；SAP 虽无需酚抽提，但 circRNA 全流程包含 RNA 变性、核酶环化、RNase R 消化等 50–65℃保温工序，该温度易造成 SAP 中途提前失活、脱磷不完全，难以适配核酸药物 CMC 简洁化生产需求。

想要解决以上实验瓶颈，核心突破口便是去磷酸化，这一步骤贯穿 circRNA 制备两大关键阶段，直接决定模板质量与最终环化效率。

1. 质粒模板构建阶段：消除载体自连，获得高阳性重组模板

circRNA 骨架质粒需插入环化内含子、目的编码序列，经限制性内切酶线性化后插入目的片段。若不进行去磷酸化处理，线性载体两端 5’磷酸会被 T4 DNA 连接酶识别，发生载体自连，转化平板布满空载菌落，大幅增加筛选成本，甚至无法扩增足量模板用于大规模体外转录。

碱性磷酸酶可水解 DNA 5’端磷酸基团，生成 5’羟基末端，从根源抑制空载自连，显著提升阳性克隆比例，为后续质粒扩繁、线性化 IVT 提供高质量起始模板。

图1. 去磷酸化过程影响载体自连示意图

2.  IVT 与 RNA 环化前处理：清除干扰杂质，提升闭环产物比例

T7 体外转录产出的线性 RNA 带有 5’三磷酸末端，而 T4 RNA 连接酶仅识别 5’单磷酸底物，大量三磷酸基团会严重抑制环化效率；同时体系中未参与反应的游离 dNTP，会持续干扰 RNA 末端修饰、环化反应，降低终产物纯度。

碱性磷酸酶可同步水解 DNA/RNA 5’、3’末端磷酸单酯，高效降解体系内游离 NTP、dNTP，统一 RNA 末端为羟基结构；后续经 T4 PNK 重新加单磷酸后，环化反应效率显著提升，线性杂质大幅减少，有效降低下游色谱纯化压力，适配工业化放大生产。

图2. IVT 与 RNA 环化前处理示意图

翌圣生物高性能 Antarctic Phosphatase（简称 AnP, Cat#14511ES），依托独特热敏感应特性，针对性解决 circRNA 模板构建、RNA 前处理全流程痛点。

该酶由大肠杆菌重组表达，源自南极细菌不耐热碱性磷酸酶，可非特异性催化 DNA、RNA 的 5′和 3′末端磷酸单酯去磷酸化，同时可高效水解核糖核苷酸及脱氧核糖核苷三磷酸（NTP 和 dNTP），此外还能特异性作用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化，适配于 circRNA 载体构建、RNA 环化前处理、circRNA 互作蛋白机制研究多类实验。

图3. AnP催化DNA末端磷酸基团水解的工作原理示意图

相比其他碱性磷酸酶，其最显著的优势在于热敏特性，75℃加热 5 min即可完全不可逆失活，无需在连接或末端标记前进行复杂的酶去除操作，从根本上简化实验流程，解决传统酶处理后纯化步骤繁琐的痛点。

主流碱性磷酸酶circRNA应用场景选型参考

市面上碱性磷酸酶品类较多，不同产品的灭活条件、酶学性能差异明显，适配的 circRNA 研发阶段也各有局限。为方便各位快速选型，我们将三款主流碱性磷酸酶的核心特性与 circRNA 适配情况整理对比：