Antarctic Phosphatase (AnP) 实验操作指南

—————————DNA/RNA 去磷酸化、载体构建与蛋白研究一站式方案

Antarctic Phosphatase(简称 AnP,Cat#14511ES)由大肠杆菌重组表达来源于 Antarctic bacterium 的 TAB5 AP 基因。该酶可非特异性催化 DNA 和 RNA 的5′及3′末端磷酸单酯水解，同时可高效水解 NTP 和 dNTP，并对蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基具有去磷酸化活性。

相比传统碱性磷酸酶，AnP 最核心的差异化优势在于其热敏特性：75℃加热仅需 5 分钟即可实现完全且不可逆的失活。这意味着在经过去磷酸化处理后，无需进行酚/氯仿抽提、柱纯化或沉淀回收等额外步骤，可直接进入连接或末端标记等下游反应，显著简化实验流程、减少样品损耗。

以下为翌圣 AnP（5 U/μL）在三种典型实验场景中的标准操作方案。

  

场景一：DNA/RNA 末端去磷酸化

这是 AnP 最常用的应用场景，适用于克隆载体去磷酸化（防止自连）、T4 PNK 末端标记前处理（去除内源性磷酸基团）、以及测序/SNP 分析前 PCR 产物中残留 dNTPs 的清除。

标准反应体系（20 μL）

 

操作步骤

① 按上述体系在冰上配制反应混合液，轻柔吹打混匀（勿涡旋振荡，避免酶失活）。

② 置于 37℃ 孵育 15–60 min。对于常规末端去磷酸化，15 分钟即可完成；如需处理大量末端或难脱磷的底物，可适当延长至 60 分钟。

③ 孵育结束后，将反应管置于 75℃ 加热 5 分钟，使 AnP 完全且不可逆地失活。冷却至室温后，即可直接用于下游连接或标记反应。

实验 Tips

• 反应体系可按需等比例放大，1 pmol DNA 末端约对应 1 μg 的 3 kb 质粒。

• AnP 兼容多种限制性内切酶缓冲液及 PCR 缓冲液，在上述缓冲液体系中仍保持良好活性。反应体系中适当添加一价盐（如 NaCl）后可进一步提高 AnP 的催化效率。

• 避免在反应体系中引入 EDTA、无机磷酸盐或磷酸盐类似物，上述成分会通过螯合 Zn²⁺/Mg²⁺ 或竞争活性位点抑制 AnP 活性。还原剂（DTT、β-ME）亦会降低酶活，应尽量避免添加。

  

场景二：质粒酶切同步去磷酸化

当使用单酶切策略构建克隆载体时，酶切线性化与去磷酸化可在同一管中一步完成，省去中间回收纯化步骤，将实验流程从"酶切→纯化→脱磷→再纯化"简化为"酶切+脱磷一步→灭活"，显著缩短操作时间，减少样品管间转移损失。

反应体系

 

操作步骤

① 按上表配制酶切反应体系（不含 AnP），根据内切酶说明书推荐条件进行酶切反应至完全线性化。

② 酶切完成后，直接向反应管中加入 1 μL Antarctic Phosphatase (5 U/μL)，37℃ 孵育 15–60 分钟进行去磷酸化。

③ 根据 AnP 和所用限制性内切酶的热灭活条件终止反应。大多数情况下，75℃ 加热 5 分钟可同时使 AnP 和常见内切酶（如 HindIII、EcoRI、BamHI 等）失活；如限制性内切酶需更高温度或更长时间灭活，请以内切酶说明书为准。

实验 Tips

• AnP 可直接在商品化限制性内切酶缓冲液中工作，无需更换缓冲液体系。建议在首次使用时对内切酶与 AnP 的兼容性进行验证。

• 若同步去磷酸化后发现连接效率偏低，可尝试延长去磷酸化孵育时间至 60 分钟，或适当增加 AnP 用量至 2 μL。

• 双酶切策略中若两种酶的缓冲液兼容，同样可在双酶切完成后直接加入 AnP 进行同步脱磷处理。

   

场景三：蛋白去磷酸化

AnP 对蛋白质的磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基同样具有高效的去磷酸化活性，可用于磷酸化蛋白质组学研究、信号通路中磷酸化状态分析以及 Western Blot 检测前的样品处理。

标准反应体系（50 μL）

 

操作步骤

① 按上表在冰上配制反应体系，轻柔混匀。

② 37℃ 孵育 60 分钟。根据目标蛋白的磷酸化程度和结构特征，孵育时间可在 30–120 分钟范围内调整。

③ ⚠ 重要：蛋白去磷酸化不能使用 75℃ 热灭活方式（高温会导致蛋白变性）。推荐以下两种方法终止反应：a. 加入 EDTA 至终浓度 50 mM；b. 加入钒酸钠至终浓度 10 mM。灭活后可直接用于后续 SDS-PAGE 或功能分析。

实验 Tips

• 蛋白去磷酸化效率受目标蛋白的三维结构、磷酸化位点的溶剂可及性以及蛋白浓度影响较大。建议在首次实验时设置时间梯度（30 min、60 min、120 min）以确定最佳孵育时长。

• 若蛋白溶液中含有磷酸盐缓冲液（PBS）或含磷酸基团的小分子，建议在去磷酸化反应前通过透析或脱盐柱更换缓冲液。

• 钒酸钠作为磷酸酶抑制剂，用于终止反应后可持续保护目标蛋白的剩余磷酸化状态。

   

实验优化要点汇总

为保证 AnP 在各类实验场景中发挥最佳性能，以下关键条件值得特别注意：

• 【提升活性】反应体系中适量添加一价盐（如 NaCl）可提高 AnP 的催化效率；AnP 是 Zn²⁺ 和 Mg²⁺ 依赖型酶，反应体系需确保含有足够的锌离子和镁离子（10×AnP Reaction Buffer 已合理配置）。
• 【抑制活性】EDTA、EGTA 等金属螯合剂会螯合 Zn²⁺/Mg²⁺ 而抑制酶活；无机磷酸盐和磷酸盐类似物通过产物抑制效应降低活性；DTT、β-ME 等还原剂也会使酶活降低，应尽量避免。
• 【灭活策略】核酸实验优先使用 75℃/5 min 热灭活，简单高效；蛋白实验用 EDTA（50 mM）或钒酸钠（10 mM）化学灭活。

  

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