产品描述

Alkaline Phosphatase，中文名碱性磷酸酶，可将DNA、RNA的5’端磷酸基团去除，常用于阻止载体的自连作用：在分子克隆实验中，DNA连接酶催化DNA连接时需要有磷酸基团的存在，载体在经酶切后会在切点端保留一个磷酸基团。而载体经碱性磷酸酶去磷酸化后因5’端无磷酸基团，因而不可以和自身3’端连接。因此连接反应中载体本身会优先发生的连接反应被阻止，提高了目的片段插入率。另外，碱性磷酸酶还可制备用于5’端标记的DNA模板，以及用于该酶蛋白的脱磷酸作用等。

本品为小牛肠来源的碱性磷酸酶，可以降解几乎所有磷酸单酯，但是该酶不能水解磷酸二酯或磷酸三酯。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		10321ES80（1000 U）
10321-A	Alkaline Phosphatase (30 U/μL)	1000 U
10321-B	10×AP buffer	1 mL

产品性质

来源（Source）	携带小牛肠碱性磷酸酶表达质粒的酵母
质量控制（Quality Control）	无核酸外切酶、核酸内切酶、核糖核酸酶污染
热灭活（Thermal Inactivation）	在螯合剂存在下，65℃加热30 min，99%活性不可逆丧失；使用苯酚，可使酶完全失活。
储存液条件（Storage   conditions）	10 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM MgCl2，50 mM KCl，0.1 mM   ZnCl2，50% glycerol.
活性定义（Unit definition）	在pH9.8，37℃条件下，以对硝基苯酚磷酸盐（p-nitrophenylphosphate）为底物，1分钟生成1 µmol硝基酚(p-nitrophenol)所用的碱性磷酸酶量定义为1个活力单位。
最佳pH（Optimal pH）	该酶在底物浓度高的情况下其最佳反应pH为10，在底物浓度低时，最佳pH为8，此时该酶活性较高浓度底物时稍低。
优化体系（Optimal Buffer）	AP Buffer（500 mM Tris-HCl pH9.0，10 mM   MgCl2）

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）本产品仅作科研用途！

使用方法

1 DNA去磷酸化

① 在1.5 mL离心管中加入下列试剂：

组分	体积
无菌ddH2O	Up to 50 µL
DNA 片段*	1-20 pmol
Alkaline   Phosphatase	1-2 µL
10×AP buffer	5 µL

【*】单链DNA或含5’端突出末端的DNA推荐低温下孵育，平末端DNA或含3’突出末端的DNA建议在较高温度下孵育。

② 混匀上述试剂，于37℃或50℃孵育30 min。或者37℃孵育15 min后，再于50℃孵育15 min。

 

2 酚氯仿法抽提DNA

① 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提2次。

【注】：推荐在酚提取前将其在含5 mM EDTA，0.5% SDS，50 μg/mL Proteinase K的溶液中56℃孵育30 min以彻底灭活碱性磷酸酶。在酚提取前于75℃孵育10 min，灭活效果更佳。

② 氯仿/异戊醇（24:1）抽提。

 

3 乙醇沉淀DNA

① 加入2.5 µL 3 M NaCl（终浓度150 mM）。

② 加入125 µL（2.5倍体积）预冷乙醇，混匀后于-20℃放置30-60 min，沉淀DNA。

 

4 溶解DNA

离心，彻底去除乙醇后，将DNA溶于适量去离子水（＜20 µL）。

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HB210709