导读

肿瘤组织并非由癌细胞单独构成，而是一个包含免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及微生物在内的复杂生态系统。近年来，随着高通量测序技术的进步，研究者发现肿瘤组织内定植着多样化的微生物群落——肿瘤微生物组（Tumor Microbiome）。这些微生物通过代谢产物、免疫调节及基因毒性等多种途径，深刻影响着肿瘤的发生、进展及治疗应答。本文将从研究背景、技术应用、实验流程及决策依据四个维度，系统梳理肿瘤微生物组学的研究路径与前沿进展。

一、背景：肿瘤微环境中的“暗物质”被照亮

长期以来，学界普遍认为肿瘤组织处于无菌状态。这一认知在21世纪初被逐步打破。随着16S rRNA测序和宏基因组测序技术的普及，研究者已在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种实体瘤组织中检测到特征性的微生物群落。

肿瘤内微生物的来源主要有三条途径：（1）来自黏膜部位（如肠道、口腔）的微生物穿透黏膜屏障进入肿瘤；（2）来源于邻近正常组织中已存在的微生物；（3）通过血液循环播散至肿瘤部位的微生物。这些微生物一旦在肿瘤微环境中定植，便与宿主细胞形成复杂的互动关系。

目前，16S rRNA基因扩增测序是肿瘤微生物组研究的主流技术手段。该基因存在于所有原核生物中，由保守区和可变区交替排列，保守区可用于通用引物设计，可变区则携带物种特异的进化信息。相较于宏基因组测序，16S测序不受高比例宿主DNA干扰，成本更低，更适合大规模队列研究。

从基础研究到临床转化，肿瘤微生物组学正经历从“描述现象”到“揭示机制”再到“指导诊疗”的三级跃迁。一项涵盖2839个样本、9种癌症类型的泛癌种研究显示，不同癌种具有独特的微生物特征，且基于微生物标志物的机器学习模型可实现高精度癌症诊断。这标志着肿瘤微生物组学已进入临床转化的快车道。

二、技术应用：从菌群图谱到诊疗标志物

1. 肿瘤内微生物群落的物种组成分析

不同癌种的微生物群落结构存在显著差异。泛癌种分析显示，结直肠癌、口腔癌和膀胱癌的微生物多样性相对较高，而胃癌则表现出多样性下降的特征。特定菌属与特定癌种的关联已被反复验证：乳腺癌组织中富集Ralstonia和Treponema，膀胱癌组织中富集Fusobacterium，结直肠癌组织中Fusobacterium nucleatum的富集更是被确认为促癌标志物。

这些差异不仅体现在物种丰度上，更反映在微生物共发生网络的复杂性中。研究发现，胃癌组织内的微生物互作网络最为复杂，提示微生物-微生物互作可能在胃癌发生中扮演特殊角色。

图1 多种癌症类型中瘤内微生物群分析（图片来源：网，侵删）

2. 微生物功能通路与宿主互作机制

单纯知道“谁在肿瘤里”远远不够，研究者更关注“它们在做什么”。通过PICRUSt2等工具对16S测序数据进行功能预测，可揭示肿瘤微生物群落富集的代谢通路。不同癌种呈现差异化的代谢和免疫相关微生物功能谱，提示微生物可能通过代谢产物调控局部免疫微环境。

以结直肠癌为例，Fusobacterium nucleatum可通过激活IL-8/TNF-α炎症通路、破坏肠道屏障蛋白、促进脂质合成等多重机制驱动肿瘤进展。短链脂肪酸（SCFAs）产生菌则通过促进调节性T细胞分化，影响抗肿瘤免疫应答及免疫检查点抑制剂疗效。

3. 微生物标志物用于癌症诊断与分型

基于微生物特征构建诊断模型是肿瘤微生物组学最具转化潜力的方向之一。研究者利用随机森林算法，从泛癌种微生物数据中筛选出Pelomonas和Cutibacterium等关键分类特征，实现了对不同癌种的高精度分类。按生物学或解剖学特征对肿瘤进行分组，可进一步提升诊断模型的效能。

除组织样本外，循环微生物DNA（cmDNA）和外泌体来源的微生物特征正被探索作为液体活检的新型标志物。微生物来源的细胞外囊泡携带功能性生物分子，可在血液中稳定存在，为无创肿瘤监测提供了新思路。

图2 肿瘤内微生物群落的泛癌整合分析（图片来源：网，侵删）

4. 合成微生物群落用于肿瘤干预

从“识别促癌菌”到“设计抑癌菌”，肿瘤微生物组学正迈向治疗干预新阶段。兰州大学团队基于多组学数据，设计出一种包含7种细菌的合成微生物群落（SynCom），通过竞争性抑制Fusobacterium nucleatum、修复胆汁酸代谢、激活色氨酸代谢通路，在结直肠癌小鼠模型中显著抑制肿瘤发展。这种“生态调控”策略优于传统抗生素“单纯杀菌”，体现了微生物组学指导精准干预的巨大潜力。

图3 F. nucleatum诱导的微生物和代谢疾病分析（图片来源：网，侵删）

5. 多组学整合研究

肿瘤微生物组不是孤立存在的，它与宿主基因组、转录组、代谢组形成复杂的调控网络。通过16S测序与代谢组学联合分析，可构建“菌-代-病”关联网络，揭示微生物如何通过代谢物影响宿主表型。与RNA-seq数据整合，则可定位微生物存在与宿主基因表达改变之间的关联。多组学整合正成为解析肿瘤微生物功能机制的必由之路。

三、常见实验步骤：从肿瘤样本到微生物图谱

肿瘤微生物组研究在常规16S流程基础上，需针对“低生物量、高宿主背景”的特点进行特殊优化。

1. 样本采集与保存

肿瘤组织样本的采集需严格遵守无菌操作规范，避免手术环境、器械及空气带来的外源微生物污染。推荐采集新鲜组织后立即液氮速冻，-80℃长期保存。

粪便样本作为肠道微生物组的代表，常用于结直肠癌等消化道肿瘤的研究。多点采样可捕捉肿瘤异质性对微生物分布的影响。

关键质控点：设置阴性对照（如空白样本、提取对照），用于后续去污分析。低生物量样本尤其容易受试剂盒和环境中背景菌的干扰。

2. 核酸提取

肿瘤组织微生物载量低，且存在大量宿主DNA干扰。提取策略最好能够兼顾微生物破壁效率与宿主DNA去除效果。推荐采用机械裂解（0.1 mm锆珠震荡）与化学裂解相结合的方法，确保革兰氏阳性菌及孢子菌的有效裂解。提取后的DNA需采用荧光染料法（Qubit）精确定量，避免吸光度法受杂质干扰。

3. 16S rRNA基因扩增与文库构建

引物选择：肿瘤微生物研究中最常用的是V3-V4区引物。对于FFPE等降解样本，可选用靶向5个可变区的多重扩增方案，提升低质量DNA样本的检测成功率。

建库策略：采用两步扩增法，在PCR扩增的同时引入测序接头与样本标签（Barcode/Index），显著缩短建库周期。扩增循环数需根据样本起始量优化，肿瘤样本通常需适当增加循环数以补偿低模板量。

4. 高通量测序

测序平台：Illumina 和MGI平台。

测序模式：双端读长PE250或PE300，覆盖V3-V4区域。

数据量：每个样本建议产生5-10万条高质量序列，足以覆盖肿瘤微生物群落的绝大多数物种。

5. 生物信息分析

肿瘤微生物数据的分析需建立标准化流程，以确保跨研究可比性。

质控与去噪：采用QIIME2结合DADA2进行序列质控和ASV推断，识别真实生物学序列变体。

物种注释：常用数据库包括SILVA（推荐138版本）和Greengenes。

多样性分析：α多样性（Chao1、Shannon指数）衡量样本内物种丰富度和均匀度；β多样性（Bray-Curtis距离、PCoA分析）评估组间群落差异。PERMANOVA检验组间差异的显著性。

差异物种筛选：采用LEfSe、DESeq2等方法识别肿瘤与正常组织间显著差异的微生物类群。对于配对样本（肿瘤vs癌旁），可采用配对检验提升统计效力。

互作网络构建：基于物种丰度相关性构建微生物互作网络，识别核心物种及网络拓扑特征，揭示肿瘤特异性的微生物生态模式。SpiecEasi、igraph等R包是常用工具。

功能预测：通过PICRUSt2将16S数据映射至KEGG、MetaCyc等功能数据库，预测微生物群落的代谢潜能。

四、总结：从“看到”到“用到”的跨越

肿瘤微生物组学正经历从描述性科学向机制性、转化性科学的深刻转变。过去十年，研究者完成了从“肿瘤里有没有菌”到“不同肿瘤里各有什么菌”的基础认知积累；未来十年，焦点将转向“菌如何影响肿瘤行为”及“如何利用菌来诊断和治疗肿瘤”。

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