淋巴细胞分离液（Lymphocyte Separation Medium 1.084，简称LSM-1.084）是一种无菌的即用型分离液，基于Böyum的Ficoll-甲泛影钠溶液做过一些改良，使得操作简单快速且分离效率更高。本品是无菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸钠混合溶液，密度为1.084 g/ml，内毒素含量很低（＜0.12 EU/mL），是在严格控制的环境下加工生产的，生产条件符合ISO13485:2003标准和GMP认证。相对于密度为1.077 g/mL的人淋巴细胞分离液，本品适用于分离更高密度的人单个核细胞，包括外周血，脐带血以及骨髓瘤来源的组织样本。还适用于分离大小鼠血细胞，正因为啮齿动物的淋巴细胞密度稍高于人淋巴细胞。

操作方法

1. 材料准备

1）样本体积（4 mL总体积）：取2 mL的去纤维蛋白或抗凝血，将其与等体积（2 mL）的无菌盐溶液以1：1比例混合。注：大体积的血样可以得到相同的分离效率，只需要选用更大直径的离心管，以维持血样的高度（约3 cm）和LSM-1.084溶液的高度（约2.4 cm）。

2）LSM-1.084分离液，使用前需放到室温环境下温度平衡10-30 min；

3）平衡盐溶液：用做稀释和清洗液，建议直接购买商业化的盐溶液。也可以使用其他溶液，如不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸盐溶液（如DPBS溶液），Hank’s，或者细胞培养液（如RPMI 1640）。

2. 分离单个核细胞

1）取2 mL的去纤维蛋白或抗凝血，将其与等体积（2 mL）的无菌盐溶液以1：1比例混合，于10-15 mL离心管中颠倒混匀，或用枪上下轻轻吹打数次以至混匀。

注：肝素、EDTA、柠檬酸钠、ACD、CPD抗凝皆可。去纤维蛋白血不需要抗凝剂。

2）使用前轻轻颠倒瓶子使LSM-1.084充分混合，用注射器或枪头无菌条件转移3 mL LSM到10-15 mL离心管中。

3）小心将稀释血液加入3 mL LSM-1.084（室温即可）的上层，使得在血液和LSM间形成一个明显的分层。不要将稀释血液混入LSM-1.084中，如图1。

图1. 加样后分层示意图

4）室温下400×g离心30-40 min，离心可以沉淀红细胞和多形核白细胞，同时可以在LSM-1.084上形成一层单核-淋巴细胞分层，如图2所示（从上到下，依次分为血浆层-单个核细胞层-LSM-1.084层-粒细胞-红细胞）。

5）用无菌枪头吸掉单个核细胞层（含淋巴细胞和单核细胞）上方2-3 mm的血小板/血浆，小心操作勿吸入单个核细胞层内破坏其平衡（如图2）。

注：也可以不用先吸走血浆层，直接用枪吸取单个核细胞层。另外，上层血浆不含细胞，也可以留作他用。

图2.吸除上层血浆和血小板前后分层示意图

6）用无菌枪头将单核细胞层转移入一个新的无菌离心管。

注：一定要吸取所有的单个核细胞中间层，以及少量上方的血浆液和下方的LSM-1.084分离液。

7）预估转移后的单个核细胞量，加入至少3倍体积（约6 mL）的平衡盐溶液于上述离心管中。

8）使用枪头上下轻轻吹打将单层细胞溶液充分悬浮。

9）室温400-500×g离心10-15 min。

注：高速离心有助于提高单个核细胞的回收率，但如果需要彻底去除血小板，则推荐低速离心（60-100×g）。

10）去除上清，加入6-8 mL平衡盐溶液重悬单核细胞。

11）室温400-500×g（或者60-100×g去除血小板）离心10 min。

12）去除上清，用适当培养基重悬单个核细胞备用。

3. 分离粒细胞

1）-6）同上方单个核细胞的分离步骤。

7）小心吸除LSM-1.084层，注意切勿吸入粒细胞层。

8）转移暴露在表面的白色粒细胞层（位于红细胞层上方）于一个无菌的50 mL离心管。

9）加入至少5倍体积的平衡盐溶液重悬粒细胞，于400×g离心15 min。

10）吸除上清，加入6-8 mL平衡盐缓溶液重悬粒细胞，于室温400-500×g离心10 min。

11）吸除上清，用适当培养液重悬粒细胞备用。

室温运输。4-30 °C密闭避光环境下可稳定保存3年，开瓶后需4-8 °C保存。