无细胞蛋白表达系统是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物或蛋白表达所必须的酶和辅因子重构体系中利用氨基酸和能量合成蛋白质的体外反应系统。本试剂盒提供能够通过质粒或线性模板，实现目的蛋白质的快速、高效表达，试剂盒采用转录和翻译偶联的方法，通过“一锅式”反应表达目的蛋白。该试剂盒提供的表达系统主要包含：A液和B液。A液：优化的反应缓冲液体系及优化浓度比例的氨基酸，通过ATP再生系统持续为蛋白质合成提供能量及供给合成蛋白质所需的基本原料。B液：优化的大肠杆菌提取物，增加了DNA转录和翻译过程中结构的稳定性，增加可溶性蛋白的产量。另外，为了能直观地观测试剂盒性能，本试剂盒额外附赠PC质粒，PC质粒不是试剂盒使用的必备条件，也可采用其他以T7为启动子且不含lac操纵子的质粒形式，如pet14b。
无细胞蛋白表达系统试剂盒（全长抗体版）适用于全长lgG抗体、Fab抗体和抗体高通量筛选。
另外，我司还提供适合其他应用场景的无细胞蛋白表达系统试剂盒：
基础型（Cat#36850ES）适用于大多数蛋白包括抗体和酶的表达；
增强型（Cat#36851ES）适用于绝大多数蛋白包括膜蛋白和全长抗体的表达；
高通量版（Cat#36852ES）适用于蛋白、酶、抗体的高通量筛选。
1.快速：最快只需要1小时即可表达目的蛋白。
2.模板灵活：支持线性模板、质粒模板以及PCR产物。
3.表达量高：最高可实现3 mg/mL以上产率的蛋白制备。
4.蛋白共表达：可在同一反应中进行多目的蛋白的同时表达。
5.操作简单：一步反应，仅需将反应组分与DNA模板混合即可制备蛋白。
6.高通量：反应也可在96孔板中进行，当检测到阳性表达后，可进行体系放大。
7.适用蛋白种类多：可表达各种类型的蛋白，包括富含二硫键的蛋白、膜蛋白等。
使用说明
无细胞反应快速指南
1）反应液的准备
a.将所需用到的试剂放在冰上静置至完全融化；
b.可将组分A和组分B混合均匀，根据需要进行分装，剩余的试剂用液氮速冻后置于-85~-65℃冰箱储存，避免反复冻融；
c.按参考的反应体系添加各试剂、移液器吹吸混合均匀，避免剧烈震荡；（建议使用的模板终浓度为5-20 ng/μL）
2)反应的启动和进行
a.将混合好的反应液至于设备中反应6小时，一般推荐2-6 h反应时间。推荐复杂蛋白首次反应过夜进行（16 h）以保证目的蛋白完全表达。过夜反应时应在微孔板四周空余位置加适量水，并在摇床内放置含水的50 mL离心管，增加摇床内湿度以防止反应液蒸干。(建议使用恒温混匀仪如我司Cat#80440ES，模块Cat#80910ES，，25℃，600 rpm，或者使用摇床25℃，180 rpm）
b.离心（4℃，10000 g，2 min）
c.取上清进行鉴定
3)蛋白表达结果鉴定
本试剂盒采用GFP绿色荧光蛋白作为阳性对照，可通过使用具有荧光信号读取功能的仪器（酶标仪、荧光显微镜等）检测或直接肉眼观测反应液荧光，进行GFP表达鉴定（ex/em：485/535 nm）。对于目的蛋白的表达结果可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western免疫印迹分析等方法进行鉴定。
4)蛋白表达结果小量纯化鉴定操作示例
注：该方案所使用到的试剂需自行购买，本试剂盒内不予提供。可以根据自己所有的试剂及反应体积，灵活在以下两种手段中选择。
方法一：通过Ni磁珠纯化
a.取反应上清：反应后样品30 μL，12000 g，2 min，4℃离心，取上清备用；
b.准备Ni磁珠：取25 µL磁珠置于1.5 mL离心管中，用50 µL的1×PBS洗2次；
c.孵育：向有磁珠的1.5 mL离心管中加入250 µLPBS，30µL 反应上清，1.2 µL 500 mM咪唑洗脱液（即咪唑终浓度为2 mM），4℃孵育2h（旋转混合仪缓慢摇动）
d.洗涤：用250 μL，5 mM的咪唑洗涤液洗3次
e.洗脱：用50 μL，500 mM的咪唑洗脱液洗脱1次
注：
a.磁珠洗涤和洗脱操作均使用涡旋仪震荡2到3次，每次2-3 s，其余时间置于冰上，保持低温；
b.膜蛋白进行纯化操作时，需在洗涤和洗脱用的咪唑液中加入一定量的去垢剂以稳定目的蛋白。
| 表面活性剂 | Brij35 | DDM | Brij 58 | Brij 78 | TritonX-100 |
| 使用终浓度 | 0.05% | 0.06% | 0.2% | 0.2% | 0.1% |
方法二：通过Ni珠纯化
a.取反应上清：反应后样品200 μL，12000 g，2 min，4℃离心，取上清备用；
b.准备Ni珠：取50 µL Ni珠置于1.5 mL离心管中，用50 µL的1×PBS洗2次；（离心条件：6000 g，30 s）
c.孵育：向有Ni珠的1.5 mL离心管中加入750 µLPBS，200 µL反应上清，4 µL 500 mM咪唑洗脱液（即咪唑终浓度为2 mM），4℃孵育2h（旋转混合仪缓慢摇动）
d.洗涤：用1 mL，5 mM的咪唑洗涤液洗3次，离心条件：6000 g，30 s
e.洗脱：用0.1 mL，500 mM的咪唑洗脱液洗脱1次，离心条件：6000 g，30 s
注：
a.所有Ni珠洗涤和洗脱操作均使用涡旋仪震荡2到3次，每次2-3 s，其余时间置于冰上，保持低温；
b.膜蛋白进行纯化操作时，需在洗涤和洗脱用的咪唑液中加入一定量的去垢剂以稳定目的蛋白。
| 表面活性剂 | Brij35 | DDM | Brij 58 | Brij 78 | TritonX-100 |
| 使用终浓度 | 0.05% | 0.06% | 0.2% | 0.2% | 0.1% |
所用Buffer配方
| Buffer名称 | Buffer配方 |
| 1*PBS | 10 mmol/L Na2HPO4；1.75 mmol/L KH2PO4；137 mmol/L NaCl；2.65 mmol/L KCl；pH 7.4 |
| 500 mM咪唑洗脱液 | 50 mmol/L Na2HPO4；300 mmol/L NaCl；500 mmol/L imidazole；pH 7.4 |
| 5 mM咪唑洗涤液 | 50 mmol/L NaH2PO4；300 mmol/L NaCl；5 mmol/L imidazole；pH 7.4 |
表达鉴定
a.制样
洗脱样品制样：20 µL洗脱液+5 µL蛋白上样缓冲液；95℃，5 min；
上清样品制样：2 µL上清液+18 µL PBS+5 µL蛋白上样缓冲液；95℃，5 min；
沉淀样品制样：200~300 µL反应体系的沉淀，用200 µLPBS重悬洗涤离心后，用100 µLPBS重悬，取20 µL+5 µL蛋白上样缓冲液；95℃，5 min；
b.SDS-PAGE
电泳上样量：洗脱样品制样后10 µL；反应上清样品制样后10 µL；沉淀样品制样后5 µL；
电泳条件：12%SDS-PAGE胶，100 V，1.5 h；
c.Western Blot
-85~-65℃保存，长期储存。
注：a.现用现配，如需溶解后分装试剂，推荐分装后用液氮冷激再置于-85~-65℃冰箱储存备用，避免反复冻融。
b.36853ES-D -25~-15℃保存。
