干货分享|转染效率低？小翌手把手教你做细胞转染实验

细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌蛋白组成的，带有负电荷。因此带有负电荷的DNA或RNA无法通过细胞膜。为了让核酸（DNA或RNA）通过细胞膜，研究人员利用不同的方法，包括使用化学物质和包被核酸的载体分子进行中和，以及在细胞膜上开孔等物理方法，将核酸（DNA或RNA）直接运输到细胞内。这些就是转染的过程，转染的目的是促进蛋白合成，调节基因表达，促进细胞生长与发育等，目前越来越多地被用到功能研究中。

图1. DNA/RNA转染过程

（图片来源：图片来源于网络）

1.常见转染方法

根据导入的核酸在目的细胞中存活时间的长短，可以将转染技术分为瞬时转染和稳定转染。也可以根据转染方式的不同，分为化学转染，物理转染、和生物转染方法。例如脂质体转染、阳离子聚合物PEI转染、电转、显微注射、以及慢病毒包装转染等等。

但是，没有一种转染试剂可以满足所有的实验要求。必须根据您的细胞类型（贴壁细胞、悬浮细胞）、外源核酸种类（DNA、RNA）、基因表达时间、细胞毒性、转染效率等，操作是否简便等因素，挑选出最理想的转染试剂。

化学转染
技术	描述	特点及优点
脂质体转染(货号：40802)	阳离子脂质体成分，血清的存在不会影响转染效率，适用顺转和稳转	1.适用于DNA、RNA和寡核苷酸的转染； 2.真核细胞具有很高的转染效率； 3.细胞毒性低；操作简便； 4.转染效率高。
磷酸钙法(货号：40803)	基于形成磷酸钙-DNA沉淀的原理，适用顺转和稳转	1.适用于DNA转染； 2.真核细胞具有很高的转染效率； 3.细胞毒性低；操作简便； 4.转染效率高。
聚合物PEI转染(货号：40806)	非脂质体PEI阳离子、两性分子转染试剂，适用于siRNA和miRNA的转染。	1.90%以上的基因沉默效率； 2.可转染siRNA/miRNA；3.毒性低。
物理转染
电转	通过高脉冲电压将DNA导入细胞中，适用顺转和稳转	1.多应用于基因工程细胞； 2.适用于DNA转染； 3.转染效率高。
生物转染
病毒转染(货号：41102)	三质粒系统，适用顺转和稳转	1.兼容二代和三代的慢病毒包装质粒包装； 2.时间间隔短，大约一周； 3.病毒滴度高。

图2. 不同转染方法的原理和优点

在细胞转染过程中，即使选对了合适的细胞转染试剂，还是不可避免会出现各种令人头疼的问题，例如，转染效率低，细胞死亡，重复性差等问题。对于这些问题，我们接下来会详细剖析。

2.转染效率低

图片.png

2.1 转染前

1）核酸纯度不够，比如DNA/RNA不纯、质粒中含有内毒素、核酸不完整、核酸浓度过低均会导致转染效率低。建议使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。

2）要检测所用的无血清培养基与转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 与转染试剂不相容。

3）用了含有血清的培养基制备转染复合物。血清会降低复合物的形成。建议用无血清培养基稀释DNA/RNA和转染试剂。

4）DNA或RNA的复合物形成的比例，一般DNA（µg）：转染试剂（µL）=1:2~1:3；而RNA（ng）：转染试剂（µL）=9:1~3:1。

5）复合物孵育时间过短，未能充分形成复合物。建议复合物孵育时间10~20 min。

6）转染试剂保存不当，降低转染效率。保存在4 ºC冰箱，不可冻存，避免反复长时间开盖。

2.2 转染时

7）细胞密度过低或过高。DNA转染细胞密度90%~95%，RNA转染细胞密度30%~50%。

8）细胞生长状态不佳。清除支原体、真菌、细菌等污染，保证提供新鲜的生长培养基。

9）转染时细胞上清液中含有抗生素、生长因子等，大大降低转染效率。

2.3 转染后

10) 转染时间过短。一般质粒表达水平在24~48h，mRNA表达水平在24~72 h，蛋白表达水平在48~96 h。

3.细胞毒性大

3.1 转染前

1）核酸纯度不纯也会造成细胞毒性。要确保质粒中无内毒素，使用高纯度的DNA或RNA会降低细胞毒性。

2）转染试剂过量。优化转染试剂的用量，以及优化复合物的比例。

3）要检查稀释复合物的培养基与细胞的相容性，已知DMEM培养基对一些昆虫细胞系有毒性。建议选择合适的培养基。

3.2 转染时

4）细胞密度过低，会导致部分细胞死亡。DNA转染细胞密度90%~95%，RNA转染细胞密度30%-50%。

5）细胞生长状态不佳。清除支原体、真菌、细菌等污染，保证提供新鲜的生长培养基。

3.3 转染后

6）转染后目的蛋白的过度表达对细胞产生毒性。建议及时更换新鲜培养基，或者添加一些营养物质。

7）转染后表达蛋白对细胞产生毒性。建议换一种细胞系重新转染。

8）转染时间过短，就进行抗性筛选。一般质粒表达水平在24~48h，mRNA表达水平在24~72 h，蛋白表达水平在48~96 h。

9）抗性筛选时，加入的抗生素浓度过高。适当降低抗生素的浓度。

4.重复性差

4.1 转染前

1）移液误差。将DNA/RNA和转染试剂充分打匀后，用移液器缓慢均匀的吸取，避免产生误差。

2）制备复合物时，未充分混匀。将DNA/RNA和转染试剂轻轻混匀，并保证相同的孵育时间。

4.2 转染时

3）细胞密度存在差异。一般在特定的密度范围内，细胞密度越低，转染效率越低，相反越高。

4）细胞生长状态存在差异。好的细胞状态，转染效率越高。

5）细胞传代次数不同。对于多次传代的细胞，细胞的基因组和表型都会发生变化，不建议使用传代次数过多的细胞进行转染实验。

4.3 转染后

6）转染时间不一致，表达的蛋白水平会有差异。

5.相关文献及产品

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应用场景	名称	货号	规格
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA、siRNA	Hieff Trans Liposomal Transfection Reagent 脂质体核酸转染试剂	40802ES01	100 μL
		40802ES02	0.5 mL
		40802ES03	1.0 mL
		40802ES08	5×1mL
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA	Calcium Phosphate Cell Transfection Kit 磷酸钙法细胞转染试剂	40803ES70	200 T
用途：病毒感染+DNA转染	Polybrene (hexadimethrine bromide) 聚凝胺（10 mg/ml）	40804ES76	500 μL
用途：病毒感染+DNA转染	Polybrene (hexadimethrine bromide) 聚凝胺（10 mg/ml）	40804ES86	5×500 μL
细胞类型：悬浮核酸类型：DNA、siRNA	Hieff Trans Suspension Cell-Free Liposomal Transfection Reagent 悬浮细胞专用脂质体核酸转染试剂	40805ES01	100 μL
		40805ES02	0.5 mL
		40805ES03	1.0 mL
		40805ES08	5×1 mL
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：siRNA、miRNA	Hieff Trans in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent siRNA/miRNA体外转染试剂	40806ES01	0.1 mL
		40806ES02	0.5 mL
		40806ES03	1.0 mL
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA、siRNA、miRNA	Hieff Trans Universal Transfection Reagent Hieff TransTM通用型转染试剂	40808ES02	0.5 mL
		40808ES03	1 mL
		40808ES08	5×1 mL
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA	Polyethylenimine Linear(PEI) MW25000 线性PEI转染试剂MW25000	40815ES03	1 g
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA	Polyethylenimine Linear(PEI) MW25000 线性PEI转染试剂MW25000	40815ES08	5×1 g
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA	Polyethylenimine Linear(PEI) MW40000（rapid lysis）线性PEI转染试剂（速溶型）MW40000	40816ES02	100 mg
细胞类型：贴壁/悬浮核酸类型：DNA		40816ES03	1 g