JC-1作为线粒体膜电位检测最理想的染料是以电势依赖性的方式积聚在线粒体内：如下图示，在正常线粒体中JC-1聚集在线粒体基质形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm；Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm；Em=529 nm）。

JC-1不仅可用于定性检测，因颜色的变化能够直接反映出线粒体膜电位的变化，也可以用于定量检测，可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量线粒体的去极化。

实验试剂

1、JC-1（Cat#40705ES）

2、DMSO（Cat#60313ES或DMF）

3、1×PBS buffer，pH 7.4（Cat#41403ES）

4、DMEM培养基（Cat#41406ES）

操作步骤

1、JC-1储存液及工作液的配置

储存液的配置：JC-1分子量为652.23 ，如将5 mg JC-1完全溶于1 mL无水DMSO中即可配成5 mg/mL的储存液，浓度约为7.67 mM。

注意：-20℃避光干燥保存，可进行分装以避免反复冻融。40705ES03产品本身为已经溶解好的JC-1溶液，浓度为5 mg/ml，体积为200 μL，共1 mg。

工作液的配置：将冻存的储存液置于室温充分融化，如不能完全融解可于20~25℃水浴短暂加热，然后使用37℃预热的PBS buffer或预热的培养基稀释储存液到需要的工作液浓度，边震荡边稀释，充分混匀，避光。

注意：

①工作浓度可参照1~10 μM。

②因JC-1不溶于水，很可能在稀释到工作液的过程中形成聚集颗粒，建议13,000 x g离心JC-1工作液1 min，小心吸取上清转移到新的EP管。

③如工作液澄清无沉淀，孵育后出现沉淀，则可在工作液中添加0.1%的Tween 20。

2、 阳性对照

膜电位检测中常用阳性对照有CCCP、FCCP及缬氨霉素（valinomycin）等 ，对于特定的细胞阳性对照使用的工作浓度和处理时间会有所不同，可参阅相关资料或文献。下面列举经过验证的可参考的数据：

3、JC-1染色步骤

贴壁细胞

1）使用共聚焦小皿或细胞爬片，参照阳性对照选择合适的试剂进行凋亡诱导。

2）染色前开始配制JC-1工作液，工作浓度参考1~20 μg/mL，不同细胞系合适浓度会存在差异，具体可参见下表。

3）吸掉细胞培养液，然后加入足够覆盖所有细胞的JC-1工作液，于37℃，5% CO2培养箱孵育15-30 min。

注意：孵育时间可根据预实验结果进行缩短或延长。

4）吸掉培养液后用PBS缓冲液清洗细胞2次。

5）加入新鲜细胞培养液（可含有血清和酚红）或PBS缓冲液，于荧光显微镜或者共聚焦显微镜下检测。

 悬浮细胞

1）细胞铺板密度为5×105 cells/mL，37℃ 5% CO2培养箱培养过夜，选择合适的化合物如CCCP根据合适的浓度和时间进行凋亡诱导。

2）取0.5 mL细胞悬液至无菌的离心管内，室温条件400 x g离心5 min，弃掉上清。

3）用0.5 mL JC-1工作液重悬细胞，工作浓度可参考上表，一般10 μg/ml适用于多种细胞，于37℃ 5% CO2培养箱孵育10-30 min；

注意：孵育时间可根据预实验结果进行缩短或延长。

4）室温条件400 x g离心5 min；弃掉上清，用2 mL细胞培养液或者缓冲液清洗2次；

5）用0.5 mL新鲜培养液或者缓冲液重悬细胞，即可使用流式细胞仪进行检测。

注意：

JC-1单体（JC-1 monomer）为绿色荧光，最大激发波长Ex为514 nm，最大发射波长Em为529 nm；

JC-1聚合物（JC-1 aggregate）为红色荧光，最大激发波长Ex为585 nm，最大发射波长Em为590 nm。

在荧光显微镜/共聚焦显微镜中推荐分别使用FITC及TRITC(或Texas Red）进行检测，在流式细胞仪中推荐使用488nm激发的FITC通道以及561nm激发的PE通道，如下图在BD流式仪中最适检测通道为：488nm激发的BD Horizon BB515,FITC,Alexa Fluor 488，以及561nm激发的PE通道。

如没有561nm激发器，也可使用488nm激发的PE通道，但需要对检测结果进行补偿调节，需要进行调节的原因是当使用488nm进行激发时不仅可检测到单体也可以检测到聚合体，如下图示：使用Zeiss LSM 510 META 共聚焦显微镜对JC-1染色的Hela细胞分别使用488nm、405nm、561nm进行激发检测时出现488nm激发时可同时检测到JC-1单体和JC-1聚合物。

使用DMSO和1 μM valinomycin对L1210细胞分别处理30 min后混合，经JC-1染色后使用LSRII流式细胞仪分别使用488 nm、405 nm及561 nm进行激发，滤光片选择525/50 nm和585/42 nm，结果表明当使用488 nm激发时细胞未能呈现较好的分群，同样表明当使用488nm激发时会同时检测到JC-1单体和JC-1聚合物，需选择合适的激发器或进行光补偿调节。

参考文献

Perelman, A., Wachtel, C., Cohen, M. et al. JC-1: alternative excitation wavelengths facilitate mitochondrial membrane potential cytometry. Cell Death Dis 3, e430 (2012). https://doi.org/10.1038/cddis.2012.171

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