背景介绍

在此前的外泌体专题中为大家分享过“吐血整理外泌体标记大法(附原文献)”，这次带来外泌体提标记的protocol，为外泌体的荧光标记操作提供参考。

外泌体是含有磷脂双分子层膜结构的囊泡，用亲脂性的膜染料可以进行外泌体染色标记是比较常用且方便的，亲脂性膜染料标记外泌体的原理是：亲脂性荧光探针含有长脂肪族尾巴插入到外泌体磷脂双分子层后可以发出强烈的荧光。常用的亲脂性荧光探针主要包括DiO（绿色）、DiI（橙红色）、DiD（红色）、DiR（深红色）等。标记后的外泌体被用来研究外泌体被受体细胞摄取的成像，外泌体在小动物体内的分布追踪成像等。

这一期中我们以DiR为例，详细列出使用DiR标记外泌体时的操作，标记后的检测以及小动物成像结果。

检测操作

一、 试剂及耗材

DiR试剂（Cat#40757ES）、无水DMSO（Cat#60313ES）、PBS缓冲液（Cat#41404ES）、15 mL离心管（Cat#83505ES）、1.5 mL离心管（Cat#83510ES）、10 KD超滤管（Cat#83535ES）、超高速离心机等。

二、操作方法

1、DiR储存液及工作液的配置

1 M DiR储存液：DiR为蓝色固体，分子量为1013.4，将1.01 mg DiR完全溶于1 mL无水DMSO中。【注】：未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，可稳定保存6个月。

100 μM工作液：现用现配使用1×PBS缓冲液按照1:10稀释DiR储存液，配置为100 μM DiR工作液。

2、外泌体的标记

①在外泌体中加入对应体积的DiR工作液，外泌体蛋白量和对应染色工作液体积参考：

②涡旋振荡混匀后，于 37℃水浴或室温孵育 30 min；

③完成孵育后加入足量1X PBS混匀，120,000 g、1小时超离或使用10 KDa超滤管进行超滤以去除游离染料；

④超速离心后弃上清保留沉淀，取200 μL 1×PBS重悬沉淀物，沉淀即为染色后的外泌体；超滤管第一次离心后保留内管（此时白色滤膜上会有蓝色，为正常现象），二次离心后得到的即是已标记DiR的外泌体。

3、标记效果

标记后的外泌体可通过体外成像的方法进行初步判断是否标记成功，如下分别为DiR对外泌体标记后于EP管内直接进行成像、动物活体成像示例。

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