一、血友病简介

血友病（（hemophilia））是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，包括血友病A（hemophilia A，HA）和血友病B（hemophilia B，HB），其中以血友病A较为常见，约占血友病总数的80%。血友病A和血友病B分别由凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ，FⅧ）和凝血因子Ⅸ（coagulation factor Ⅸ，FⅨ）缺乏引起，遗传基础为相应基因的突变。血友病A（HA）是由F8基因变异引起，血友病B是F9基因突变引起，分别导致凝血因子FⅧ/Ⅸ含量下降或者活性降低。

  编码FⅧ和 FⅨ的基因均位于 X 染色体，女性常是携带者（46；XX），而男性是患者（46；XY），女性患者极为罕见（通常是由2 个FⅧ或者 FⅨ基因同时发生缺陷，或者是X 染色体非随机失活所致）。血友病的发病率没有种族或地区差异。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000，血友病B的发病率约为1/25000。所有血友病患者中，血友病A占80％-85％，血友病B占15％～20％。典型表现为关节、肌肉自发性出血或创伤后出血不止，严重者可危及生命。精准诊断对血友病的遗传咨询、产前干预及治疗方案制定至关重要。

图1：血友病致病基因及主要变异类型

二、常见检测技术手段

血友病主要通过凝血功能检查、凝血因子活性测定、基因检测等方式诊断。常见检查项目有活化部分凝血活酶时间、凝血因子VIII或IX活性检测、血管性血友病因子抗原检测、基因突变分析等。

1. 凝血功能检查
活化部分凝血活酶时间（APTT）：内源性凝血途径筛查指标，血友病患者APTT显著延长（正常值30-40秒），但重型患者可能因凝血因子严重缺乏而结果正常。

血酶原时间（PT）：外源性凝血途径指标，血友病患者PT通常正常，用于排除其他凝血障碍。

血小板计数：血友病患者血小板数量多正常，但反复出血可能导致血红蛋白下降。

2. 凝血因子活性测定
因子Ⅷ/Ⅸ活性检测：通过一期法或发色底物法直接测定凝血因子活性水平，是确诊分型的金标准。重型血友病：因子活性<1%；中型血友病：因子活性1%-5%；轻型血友病：因子活性>5%但<40%。

3. 血管性血友病因子检测

血管性血友病因子抗原和活性检测用于鉴别血管性血友病。该病表现为血管性血友病因子缺乏或功能异常，而血友病患者该因子水平正常。检查需同时测定瑞斯托霉素辅因子活性，采血前需停用影响血小板功能的药物。

4. 基因诊断

采用PCR或基因测序技术检测F8或F9基因突变，可明确遗传类型和突变位点。约95%的血友病A患者可检出F8基因倒位、缺失或点突变，该检查对产前诊断和携带者筛查有重要价值。此外，可以通过基因突变判定患者产生抑制物的风险。

图2：血友病患儿实验室检查结果

三、血友病基因突变检测方法

1. 长距离聚合酶链式反应（long-distance polymerase chain reaction，LD-PCR）和双管多重PCR：仅需一步PCR可快速、便捷地检测出F8内含子22倒位或内含子1倒位，是血友病A患者与携带者基因变异的首选筛查方法。
2. 外显子核苷酸测序：设计特异性引物扩增外显子区域，行Sanger测序，主要针对点突变以及小片段插入/缺失进行检测。
3. 高通量测序技术（next-generation sequencing，NGS）：能够快速、高效地检测出已知或未知的变异。高通量测序检出的变异位点需Sanger测序验证。
4. 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）：LD-PCR、PCR和NGS结合Sanger检测阴性时，建议MLPA补充检测，主要用于F8、F9部分外显子缺失/重复的检测。
5. 血友病PGT的检测策略：对胚胎活检样本进行单细胞全基因组扩增（single-cell whole-genome amplification，WGA），增加DNA的总量以满足多种检测策略的联合使用，推荐直接突变位点检测与连锁分析及染色体倍性分析联合的策略。目前常用的全基因组扩增技术主要有多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）、多次退火环状循环扩增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）和简并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）。

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