干货 | 溶菌酶的生产工艺和使用指南，超详细！
溶菌酶的概念
溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。
溶菌酶的作用机制
溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶的来源
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等液体，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。其中根据其来源的不同，可以将其分为四类，分别是植物溶菌酶、动物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。
图1.溶菌酶的蛋白结构（图源网络，侵删）
溶菌酶的发现过程
溶菌酶的生产工艺
传统蛋清提取溶菌酶（Lysozyme）的经典工艺流程
（以 1 kg 新鲜蛋清为原料，可放大至吨级）
1 前处理
• 打蛋 → 过滤 → 用 1–2 倍去离子水稀释，降低粘度。
• 调 pH 至 9.5（1 mol/L NaOH），蛋清蛋白充分溶胀。
2 热-盐协同沉淀
• 边搅拌边加入 5 % NaCl（w/v），继续升温至 70–75 ℃，保持 10 min。
（溶菌酶耐热，在此条件下不变性）
（卵清蛋白等杂质因热变性而絮凝沉淀）
• 立即冰浴冷却至 25 ℃，4 ℃静置 2 h，析出的沉淀离心 8 000 rpm 15 min，得上清。
3 等电点结晶
• 上清用 1 mol/L HCl 调 pH 10.5 → 10 % NaCl 饱和 → 4 ℃静置 48–72 h。
• 溶菌酶晶体析出，离心收集晶体，再溶解于 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.5）。
4 重结晶与脱色
• 溶解液再次调 pH 9.5，重复一次步骤 2-3，去除色素和杂蛋白。
• 二次结晶后纯度可达 95 %（SDS-PAGE），收率 0.35–0.45 g/kg 蛋清。
5 超滤/透析除盐
• 10 kDa 超滤膜或透析袋除盐 24 h，冻干即可得到白色粉末。
6 QC 指标
• 比活：≥9 000 U/mg（溶壁微球菌法）
• Chloride：＜3.5%
溶菌酶顾名思义是用来溶解细菌细胞壁，那么，他在细菌DNA和RNA提取中起重要作用，下面介绍一下使用方法：
细菌DNA提取
1. 取0.5-2 mL细菌培养液（最多不超过2×109个细胞），10,000 rpm离心2 min，弃上清。
【注】：菌体不宜过量，过量会严重降低产量。起始处理量与细菌密度、种类等相关。
2.先配制溶菌酶缓冲液：20 mM Tris, pH 8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2% Triton X-100，然后取一定量溶菌酶干粉加入溶菌酶缓冲液中，至终浓度为20 mg/mL。
3.针对细菌尤其是革兰氏阳性菌，加入180 μL 20 mg/mL Lysozyme振荡重悬，37℃水浴或金属浴30 min以上。
3. 加入20 μL Proteinase K (20 mg/mL)，振荡混匀。
4. 若残留RNA对后续实验有影响，可加入5 μL RNase A (100 mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5-10 min。
5. 加入200 μL结合液BD，立刻振荡混匀，70℃水浴或金属浴10 min。
DNA提取：
1. 将DNA吸附柱进行柱平衡。
2. 加入100 μL异丙醇至上述冷却后的样本预处理混合液中，立即振荡混匀，短暂离心收集管盖内的液体。
3. 将上述混合物加入DNA吸附柱中，12,000 rpm离心1 min，弃掉废液。
4. 加入500 μL去蛋白液，12,000 rpm离心30 sec，弃掉废液。
5. 漂洗2次。
6. 在DNA吸附柱中央加入30-100 µL洗脱液，离心，回收DNA溶液。
细菌RNA提取
1.先配制溶菌酶缓冲液：20 mM Tris, pH 8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2% Triton X-100，然后取一定量溶菌酶干粉加入溶菌酶缓冲液中，至终浓度为1 mg/mL。
2. 针对革兰氏阴性菌：加入 100 μL 1 mg/mL 溶菌酶工作液。涡旋振荡 10 sec，室温孵育 2 min。重复振荡孵育 3 次。
针对革兰氏阳性菌：加入 100 μL 1 mg/mL 溶菌酶工作液。涡旋振荡 10 sec，室温孵育 2 min。重复振荡孵育 6 次。
【注】细菌数多于 5×108 细胞时，溶菌酶工作液加入量为 200 μL。
3. 短暂离心收集细胞，弃上清。
4. 涡旋振荡重悬分散细胞。加入 500 μL 裂解液，反复吹打混匀，并剧烈涡旋振荡至无明显不溶物。
RNA 提取：
1. 加入上述裂解物至 DNA 清除柱中，12,000 rpm 离心 1 min，保留滤过液。
2. 加入 0.5 倍体积无水乙醇，立即吹打混匀。
3. 将上述混合物加入 RNA 吸附柱中，12,000 rpm 离心 1 min，弃掉废液。
4. 加入500 μL去蛋白液，12,000 rpm离心30 sec，弃掉废液。
5. 漂洗2次。
6. 在RNA吸附柱中央加入30-50 µL无酶水，离心，回收RNA溶液。
产品推荐
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产品名称 |
产品编号 |
用途 |
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Lysozyme 溶菌酶 |
细菌DNA提取和RNA提取 |
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Proteinase K Solution 蛋白酶K溶液（20 mg/mL, RNase-Free, DNase-Free） |
消化蛋白 |
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RNase A(100 mg/mL) |
提取DNA或质粒去除RNA残留 |
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MolPure® Bacterial DNA Kit |
细菌DNA提取试剂盒 |
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细菌RNA提取试剂盒 |
