免疫荧光实验全流程解决方案
免疫荧光（immunofluorescence，IF），是一种将免疫学方法与荧光标记技术相结合的实验技术。其基本原理是通过用荧光染料标记的抗体与待检样品中特定的抗原结合，通过荧光信号以检测蛋白质或其他生物分子进行定位、定性及定量的研究。
免疫荧光技术具有高度的特异性和灵敏度，能够检测到微量的抗原或蛋白质。它广泛应用于细胞生物学、病理学、微生物学等领域，例如用于研究细胞内蛋白质的定位、检测组织切片中的抗原分布、诊断疾病以及分析微生物感染情况等。
同时我司提供免疫组化全流程解决方案。
样本制备
1、细胞样本
贴壁细胞
1）取洁净的细胞爬片或大小合适的玻片，用5%稀盐酸浸泡过夜，纯水洗涤3次；
2）在70%乙醇中浸泡10-20 min后烘干备用；
3）先滴加少量培养基，再用无菌的镊子放置到细胞培养板/培养皿内；
4）胰酶消化贴壁细胞后，加入完全培养基，充分吹打至单细胞悬液，并调整至合适浓度（如1×10⁴~1×10⁵个/mL）；
5）将细胞加入带有无菌细胞爬片或玻片的细胞培养板/培养皿中培养；
6）待细胞状态良好且融合度达到50%-60%后，取出爬片或玻片；
7）吸去细胞培养液；
8）用适量PBS洗涤2-3次，每次3-5 s。
悬浮细胞
细胞甩片：
1) 取对数生长期细胞，弃去细胞培养液；
2) 加入适量PBS离心（350-400×g , 5 min）1-2次后重悬于PBS中；
3) 将载玻片固定于甩片机上；
4) 加0.1-0.5 mL细胞悬液至载玻片，迅速离心（1000-1200×g , 5 min）；
5) 取出载玻片，室温静置干燥。
细胞爬片：
1）取洁净的细胞爬片或大小合适的玻片，用5%稀盐酸浸泡过夜，纯水洗涤3次；
2）在70%乙醇中浸泡后10-20 min后烘干备用；
3）将合适浓度的细胞悬液直接滴在玻片上，根据细胞生长状况，适时（一般为24 h）取出爬片/玻片;
4）弃去细胞培养液，加入适量PBS洗涤2-3次，每次3-5 s；
5）室温静置干燥；
如果细胞的粘附能力不佳，可用多聚赖氨酸或者明胶预处理玻片表面5-10 min，用适量PBS洗涤后，干燥2-3 h即可使用，以促进细胞的贴壁生长。
2、组织样本
石蜡切片：是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好。
石蜡切片固定前需要进行脱蜡水化：
1) 将石蜡切片浸泡二甲苯中脱蜡5 min，再换用新鲜的二甲苯浸泡脱蜡，共脱蜡3次，每次5 min，以确保石蜡被完全去除；
2）无水乙醇洗涤2次，每次5 min；90%乙醇洗涤2次，每次5 min，70%乙醇洗涤1次，每次5 min，蒸馏水洗涤2次，每次5 min。
冷冻切片：制片速度快，对抗原影响较小。
石蜡切片固定前需要进行室温平衡：
1）将盛有组织切片的载玻片在30-37℃放置20-30 min；
2）复温后可直接进行固定步骤。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
OCT冰冻切片包埋剂（进口原料） |
118 mL |
|
|
OCT冰冻切片包埋剂 |
120 mL |
|
|
PBS (1×) 细胞培养级 |
500 mL |
|
|
PBS(10×) 细胞培养级 |
500 mL |
|
|
Gelatin, Type A A型明胶 |
100 g |
|
|
Poly-D-lysine 多聚-D-赖氨酸 (分子量:150000-300000) |
5 mg/10 mg/50 mg |
|
|
Poly-L-lysine 多聚-L-赖氨酸 (分子量:150000-300000) |
5 mg/10 mg/50 mg |
固 定
固定剂主要通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用，能使细胞内物质尽量保持其生活状态时的结构和位置，其选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用。
1）加入适当4%多聚甲醛固定液进行室温固定，细胞固定时间10-15 min，组织切片固定时间15-20 min；
2）固定结束后立即用免疫染色洗涤液（一般为PBS或TBS）洗涤1-2次，每次3-5 min。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
10%中性福尔马林溶液 |
100 mL/500 mL |
|
|
4%多聚甲醛固定液 |
100 mL/500 mL |
|
|
PBS (1×) 细胞培养级 |
500 mL |
|
|
PBS(10×) 细胞培养级 |
500 mL |
|
|
1x TBS Buffer，TBS 缓冲液(粉末)，PH 7.4,1L |
10包/袋/50包/盒 |
抗原修复
我司的改进型柠檬酸钠抗原修复液能够更有效去除因使用多聚甲醛、甲醛等醛类试剂固定后导致蛋白间的交联，并充分暴露样品中的抗原表位，从而改善免疫染色效果，获得的染色信号更强，背景更低。
1） 将切片浸泡在1×改进型柠檬酸钠抗原修复液中，95-100℃加热约20 min，（加热时间可以控制在10-30 min内，最佳加热时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索）；
2） 冷却至室温，大约为20-30 min；
3） 用免疫染色洗涤液（一般为PBS或TBS）洗涤1-2次，每次3-5 min。随后即可进行封闭等后续的免疫染色步骤。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
Improved Antigen Retrieval Buffer (50× Citrate Sodium Buffer, pH 6.0) 改进型柠檬酸钠抗原修复液（50×） |
100 mL |
通 透
如果靶蛋白位于细胞内，对细胞进行通透处理尤为关键，其有助于暴露抗原、核酸等作用靶点，使抗体、探针或标记物等更容易进入细胞内，从而确保染色等的检测效果。通透剂包括：Triton X-100 或Digitonin或 Saponin。目前，Triton X-100是最常用。
1） 切片样品：在固定、洗涤结束后，加入50~100 μL/片或者完全浸没在染色缸中；
细胞样品：在固定、洗涤结束后，按照六孔板每孔加入1 mL作为参考比例加入；
2）室温孵育5-10分钟，即可完成通透；
3）用PBS洗涤3次，每次2-3 min。
注：
1、对于较难通透的样品或者要求通透特别充分的情况，可以室温孵育10-30分钟。
2、用丙酮固定的样品不需要进行通透处理。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
Immunostaining Permeabilization Buffer with Triton X-100 免疫染色通透液(Triton X-100) |
100 mL/500 mL |
|
|
Digitonin洋地黄皂苷 |
25 mg/100 mg |
|
|
Saponin from Quillaja Bark 皂素，来源于皂树皮 |
5 g/25 g |
封 闭
加入免疫染色封闭液，一般封闭约60分钟，也可根据具体情况针对调整封闭时间，15-120分钟不等，对于背景非常高的抗体可以4℃封闭过夜。封闭时，可以放在摇床上缓慢摇动来提高封闭效果。如果样品摇动时容易脱落，也可以静置封闭，效果略有降低，但是不影响正常封闭。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
Immunostaining Blocking Buffer 免疫染色封闭液 |
100 mL |
|
|
Protein free rapid blocking buffer(1×) 无蛋白快速封闭液（1×） |
100 mL/500 mL |
|
|
Normal donkey serum 正常驴血清（进口原料） |
1 mL/10 mL |
|
|
Normal rabbit serum 正常兔血清（进口原料） |
1 mL/5 mL |
|
|
Normal mouse serum 正常小鼠血清（进口原料） |
1 mL/5 mL |
|
|
Normal goat serum 正常山羊血清（进口原料） |
1 mL/10 mL |
一抗孵育
抗体的选择，选择已通过验证可用于免疫荧光（IF）应用的一抗，来识别靶点；即可选择直接带有偶联物的一抗又可以利用普通的一抗识别靶点，然后再利用带有偶联物的二抗进行识别一抗。
1）根据一抗抗体说明书，按适当比例浓度用免疫染色一抗二抗稀释液（如1:100-1:500）稀释一抗。
2）吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗溶液，缓慢摇动孵育，4℃过夜（或室温1-2h）。
3）注意避光操作，避免荧光猝灭。
4）孵育结束后，回收一抗。
5）加入免疫染色洗涤液，洗涤3次，每次5 min，以去除未结合的抗体。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
产品详情
|
细胞器 |
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
细胞核 |
Lamin A/C Rabbit mAb |
50 μL/100 μL |
|
|
PCNA Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
||
|
Histone-H3 Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
||
|
内质网 |
GRP78/BIP Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
|
|
Calnexin Rabbit pAb |
50 μL/100 μL |
||
|
线粒体 |
HSP60 Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
|
|
Cytochrome c Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
||
|
TOMM20 Rabbit pAb |
50 μL/100 μL |
||
|
细胞骨架 |
β-Tubulin, Mouse mAb 小鼠抗β-Tubulin单克隆抗体 |
40 μL/100 μL/1 mL |
|
|
β-Tubulin, Rabbit pAb 兔抗β-Tubulin多克隆抗体 |
20 μL/50 μL/ 100 μL |
||
|
α-Tubulin, Mouse mAb 小鼠抗α-Tubulin单克隆抗体 |
50 μL/100 μL/1 mL |
||
|
β-actin, Rabbit mAb 兔抗β-actin单克隆抗体 |
40 μL/100 μL |
||
|
Vimentin Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
||
|
细胞连接 |
EpCAM Rabbit mAb |
50 μL/100 μL |
|
|
N Cadherin Mouse mAb |
50 μL/100 μL |
||
|
|
免疫染色用一抗二抗稀释液 |
100 mL |
表格仅展示部分，详情请查阅翌圣官网产品中心。
二抗孵育
1）根据二抗抗体说明书，按适当比例浓度用免疫染色一抗二抗稀释液（如1:100-1:500）稀释二抗，避光。
2）吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，荧光标记的二抗注意室温避光孵育1h。
3）孵育结束后，回收二抗。
4）加入免疫染色洗涤液，洗涤3次，每次5 min以去除未结合的二抗。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
参考 |
|
YSFluor™ 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) |
100 μL |
||
|
YSFluor™488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) |
100 μL |
||
|
YSFluor™ 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) |
100 μL |
||
|
YSFluor™594 Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) |
100 μL |
||
|
YSFluor™647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) |
100 μL |
||
|
免疫染色用一抗二抗稀释液 |
100 mL |
表格仅展示部分，详情请查阅翌圣官网产品中心。
复染、封片
1）加入0.5-10 μg/mL DAPI或Hoechst核染色剂，室温孵育5-10 min，避光操作；
2）用PBS洗涤3次，每次5 min；
3）滴加一滴Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂至载玻片，盖上盖玻片，避免形成气泡，并可用无纺纱布轻轻按压盖玻片以去除多余分封片剂和封固盖玻片。
4）室温下避光静置5 min，使得封片剂晾干后再进行显微镜检测。
封片后，样本避光低温条件下保存，建议尽快进行显微镜观察。若玻片样本需长久保存，可使用指甲油或者中性树胶对盖玻片四周进行密封。
我司有含DAPI抗荧光淬灭封片剂，可同时完成核染和封片，使得实验操作更简便。
产品详情
|
产品编码 |
产品名称 |
规格 |
|
Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂（水溶性） |
5 mL/25 mL |
|
|
DAPI Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂（含DAPI，水溶性） |
4 mL/20 mL |
|
|
DAPI 4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐 |
10 mg |
|
|
DAPI Solution DAPI染液（5 mg/mL） |
1 mg (200 μL) |
|
|
Hoechst 33258 染液（1 mg/mL） |
1 mL |
|
|
Hoechst 33342 染液（1 mg/mL） |
1 mL |
|
|
Hoechst 33342/PI 双染试剂盒 |
1 Kit（100 T） |
免疫荧光常见问题及解决方案
|
问题 |
可能原因 |
方案建议 |
|
背景高 |
一抗浓度过高 |
预实验测试，找到抗体最佳工作浓度 |
|
一抗变质、质量差的多克隆抗体 |
注意抗体的有效期，使用新抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。 |
|
|
二抗非特异性结合 |
只加二抗作为对照组 |
|
|
洗涤不足 |
充分洗涤，适当增加洗涤次数 |
|
|
封闭不充分 |
延长封闭时间或者更换封闭液 |
|
|
抗体孵育时间过长或温度较高 |
严格按照实验操作流程实施 |
|
|
样本干燥 |
使用湿盒和免疫组化笔 |
|
|
荧光无信号或信号弱 |
抗原丰度低 |
更换样本，增加阳性对照 |
|
激发波长错误 |
确保激发波长与荧光基团激发波长相匹配 |
|
|
一抗或二抗浓度低 |
提高一抗或二抗工作浓度 |
|
|
一抗或二抗孵育不充分 |
一抗或二抗充分孵育 |
|
|
未进行抗原修复/抗原修复不充分 |
进行抗原修复/延长抗原修复时间 |
|
|
一抗二抗不兼容 |
注意抗体种属问题 |
|
|
固定不充分或过度 |
调整固定时间 |
|
|
样本保存不当 |
使用新鲜样本/注意避光 |
|
|
细胞有自发光 |
使用戊二醇固定 |
在固定后，荧光染色前进行荧光猝灭，如果使用甘氨酸和NaBH4等，染色前检查自发荧光 |
|
材料本身（如石蜡）有自发光 |
||
|
细胞/组织形态破坏 |
组织切片从玻片上脱落或切片有气泡 |
适当增加固定时间 |
|
组织切片撕裂或有褶皱 |
切割刀片不太锋利，考虑重新切片 |
|
|
细胞或组织固定不充分，自发裂解 |
适当增加固定时间，使用交联性固定剂 |
