Bsu DNA polymerase (Large fragment)来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该酶保留了Bsu DNA polymeras I的5’-3’聚合酶活性，但缺失了5’-3’核酸外切酶结构域，该大片段自身缺失3’-5’核酸外切酶活性，是具有链置换活性的DNA恒温扩增聚合酶，主要应用于RPA重组酶聚合酶扩增技术。

1、由于缺乏3’-5’核酸外切酶活性，Bsu DNA polymerase (Large fragment)不能切除3’未配对的突出末端，因而不适用于生成平齐末端。

2、25℃时Bsu DNA polymerase (Large fragment)保留50%的活性，是同温度下Klenow片段(3’-5’exo-)的两倍。

3、酶保存液成分：25 mM Tris-HCl , 50 mM NaCl , 1 mM DTT , 0.1 mM EDTA , 50 % Glycerol ,pH 7.4@25℃。

4、热失活条件：75℃，20 min。

-25~-15℃保存，有效期2年。

Q: PCR的Taqman探针适用于RPA系统吗？

A: 不适用。Taqman探针需要在Taq DNA聚合酶的5’到3’外切活性下发挥功能

Q: RPA扩增技术有哪些检测形式？

A: 1. 电泳检测：在RPA的基础上，用凝胶电泳的技术进行终产物检测；

1. 探针法检测：1）EXO探针法【RPA+核酸外切酶III（exonuclease III、即exo）+exo荧光探针】2）Fpg探针法【RPA+甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（fgp）+fpg荧光探针】
2. 侧流层析试纸条（LF-RPA）：RPA+核酸外切酶IV（endonuclease IV，即nfo）+nfo探针+带有生物素或者地高辛等标记物的反向引物（肉眼即可观察扩增产物在侧流试纸条上的检测结果）。

Q: RPA扩增可以兼容哪些形式的样本？

A: 样本耐受性广泛，在某些情况下可以直接处理未经核酸纯化处理的复杂样品，比如血液、鼻拭子或培养基等。未经核酸纯化的血液或鼻拭子，只需要通过热或碱进行预处理促进核酸释放即可。（对样本的提取质量要求低于LAMP/RT-LAMP）。

Q: 琼脂糖凝胶电泳检测RPA的产物，为什么有时会检测不出来/有时条带歪歪扭扭？

A: 由于反应体系中含有较多的蛋白酶及大分子物质，可能会产生现象。可采取以下方法：使用试剂盒自带的6x DNA Loading Buffer(已添加蛋白酶K) ，按照每10 μL产物1.5 μL 6x DNA Loading Buffer 进行添加，吹打混匀后，56℃孵育 5 min，然后进行琼脂糖凝胶跑胶。方法二: 纯化扩增产物，取纯化试剂(Tris-苯酚: 仿:异醇 =25:24:1 震荡混匀后取下层液相) 与扩增产物等体积混合后震荡混匀，高速离心后的上层液体即为纯化的扩增产物，进行琼脂糖凝胶跑胶。

Q: 实验得到假阳性结果，是什么原因？

A: 测试的同一区域移液高拷贝（10^6 copies/μL或更高）的模板，则可能会发生污染；样本制备区/试剂准备区/加样区/反应区等尽可能做到分区；

每次试验前后或者步骤之间对空气和工作区以及移液器，要用核酸清除剂或10%漂白剂消毒清除气溶胶污染。