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Bradford蛋白浓度测定法是目前常用的灵敏度较高的蛋白浓度测定方法之一。它是根据Bradford染液（考马斯亮蓝G-250染料）与蛋白结合，使染料的最大吸收峰从A456变为A595，且测定的吸光值与蛋白浓度成正比关系的原理设计的。本法通过吸光值，推算蛋白浓度，实现了蛋白浓度测定的快速性和简便性。灵敏度高，比Lowry法大约高四倍，最低蛋白检测量可达1μg。测定速度快、简单，仅需一种试剂即可，且不受大多数样品中化学试剂的影响。
我司提供二种规格的Bradford蛋白浓度检测试剂盒，比色皿法分别可做125次和625次。酶标法分别可做500次和2500次。
翌圣为您提供Western Blot实验整体解决方案，相关产品选购请参考：WB实验系列产品-选购指南
产品组分
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编号 |
组分 |
产品编号/规格 |
|
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20202ES76 (500T) |
20202ES86 (2500T) |
||
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20202-A |
Bradford蛋白染色液 |
125mL |
5×125 mL |
|
20202-B |
蛋白标准品（BSA） |
5×1mL（2mg/mL） |
5×2mL（2mg/mL） |
运输与保存方法
冰袋运输。染色液4℃保存，蛋白标准品常温或4℃保存，有效期一年。
注意事项
1）Bradford染色液使用前，应充分混匀。同时，酶标仪需预热20min。
2）Bradford染色液需恢复到室温再使用，有利于提高检测的灵敏度。另，使用前需颠倒几次以充分混匀。
3）由于Bradford染液的颜色反应并不是同递增的蛋白浓度呈线性关系，因此每次试验都必须建立标准曲线。另外，为了得到更精确的结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔。
4）Bradford法测定蛋白浓度对大多数化学物质的兼容性比较好，比如对还原剂DTT的兼容性高达5mM。但会受到略高浓度的去垢剂影响，如，SDS需低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20/ 60/80低于0.015%等。对于含去垢剂的样品，建议使用BCA增强型蛋白定量检测试剂盒【货号：20201ES76】。
5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6）本产品仅作科研用途！
操作方法
一、配制标准品
1. 配制BSA标准品体系
注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。
BSA标准品体系配制可参考表一。
表一BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围100-1500μg/mL）
|
Vial |
稀释液体积(μL) |
2mg/mL BSA体积(μL) |
BSA终浓度(μg/mL) |
|
A |
0 |
100 |
2000 |
|
B |
25 |
75 |
1500 |
|
C |
50 |
50 |
1000 |
|
D |
125 |
75 |
750 |
|
E |
150 |
50 |
500 |
|
F |
350 |
50 |
250 |
|
G |
375 |
25 |
125 |
|
H |
395 |
5 |
25 |
|
I |
400 |
0 |
0=Blank |
A. 标准比色皿检测（线性范围：100-1500μg/mL）
1. 各取20μL不同浓度标准品和待测样品加入到反应管中；
2. 加入1mL Bradford染色液，混匀。室温孵育10min。【注】：样本室温孵育时间不可超过1h；
3. 分光光度计上测定595nm处的吸光度，用装满水的比色皿对仪器校零。之后测定所有样本浓度。
4. 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度μg/mL；Y-最终的OD595nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
B. 标准微孔板检测（线性范围：100-1500μg/ml）
1. 各取5μL各浓度标准品和待测样品加入到微孔板中；
2. 每孔加入250μL Bradford染色液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，室温孵育10min。【注】：样本室温孵育时间不可超过1h；
3. 酶标仪上测定595nm处的吸光度。或者其他575-615nm波长范围内的吸光度，但是相对于595nm，吸光度会存在0-10%的损失。
4. 根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度μg/mL；Y-最终的OD595nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
注：a）由于酶标板的光径比比色皿短，经酶标板检测得到的OD595nm会低于比色皿检测所得，因此可能降低本法的检测下限。要得到更高的OD595nm，可使用7-10μL标准品/待检样本，和250μL Bradford染色液来进行检测。b）如果使用与酶标仪相关的曲线拟合算法（curve fitting algorithm），那么四参数或者最佳拟合曲线可能得到更为精确的结果，并不是单纯的线性拟合。若是手动标记各点浓度，点-点曲线出来的结果精确于线性拟合。若对结果准确性的要求不是非常严格，可使用线性拟合分析数据。
附录
表：Brandford蛋白浓度测定的兼容性
|
名称（盐/缓冲液） |
耐受浓度 |
|
ACES, pH 7.8 |
100mM |
|
Ammonium sulfate |
1M |
|
Asparagine |
10mM |
|
Bicine, pH 8.4 |
100mM |
|
Bis-Tris, pH 6.5 |
100mM |
|
Borate (50mM), pH 8.5 |
undiluted |
|
Calcium chloride in TBS, pH 7.2 |
10mM |
|
Na-Carbonate/Na-Bicarbonate (0.2M), pH 9.4 |
undiluted |
|
Cesium bicarbonate |
100mM |
|
CHES, pH 9.0 |
100mM |
|
Na-Citrate (0.6M), Na-Carbonate (0.1M), pH 9.0 |
undiluted |
|
Na-Citrate (0.6M), MOPS (0.1M), pH 7.5 |
undiluted |
|
Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 |
10mM |
|
EPPS, pH 8.0 |
100mM |
|
Ferric chloride in TBS, pH 7.2 |
10mM |
|
Glycine |
100mM |
|
Guanidine•HCl |
3.5M |
|
HEPES, pH 7.5 |
100mM |
|
Imidazole, pH 7.0 |
200mM |
|
MES, pH 6.1 |
100mM |
|
MES (0.1M), NaCl (0.9%), pH 4.7 |
undiluted |
|
MOPS, pH 7.2 |
100mM |
|
Nickel chloride in TBS, pH 7.2 |
10mM |
|
PBS; Phosphate (0.1M), NaCl (0.15M), pH 7.2 |
undiluted |
|
PIPES, pH 6.8 |
100mM |
|
RIPA lysis buffer; 50mM Tris, 150mM NaCl,0.5% DOC, 1% NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0 |
1/10 dilution* |
|
Sodium acetate, pH 4.8 |
180mM |
|
Sodium azide |
0.5% |
|
Sodium bicarbonate |
100mM |
|
Sodium chloride |
5.0M |
|
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 |
200mM |
|
Sodium phosphate |
100mM |
|
Tricine, pH 8.0 |
100mM |
|
Triethanolamine, pH 7.8 |
100mM |
|
Tris |
2M |
|
TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15M), pH 7.6 |
undiluted |
|
Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 8.0 |
undiluted |
|
Tris (25mM), Glycine (192mM), SDS (0.1%), pH 8.3 |
1/2 dilution* |
|
Zinc chloride in TBS, pH 7.2 |
10mM |
|
名称（变性剂） |
耐受浓度 |
还原剂以及巯基试剂 |
耐受浓度 |
|
Brij™-35 |
0.125% |
Dithiothreitol (DTT) |
5mM |
|
Brij-56, Brij-58 |
0.031% |
Glucose |
1M |
|
CHAPS, CHAPSO |
5.0% |
Melibiose |
100mM |
|
Deoxycholic acid |
0.05% |
2-Mercaptoethanol |
1M |
|
Lubrol™ PX |
0.125% |
Potassium thiocyanate |
3M |
|
Octyl β-glucoside |
0.5% |
Thimerosal |
0.01% |
|
Nonidet P-40 (NP-40) |
0.5% |
Misc. Reagents & Solvents |
耐受浓度 |
|
Octyl β-thioglucopyranoside |
3.0% |
Acetone |
10% |
|
SDS |
0.125% |
Acetonitrile |
10% |
|
Span™ 20 |
0.5% |
Aprotinin |
10mg/L |
|
Triton™ X-100, X-114 |
0.125% |
DMF, DMSO |
10% |
|
Triton X-305, X-405 |
0.5% |
Ethanol |
10% |
|
Tween™-20 |
0.062% |
Glycerol (Fresh) |
10% |
|
Tween-60 |
0.1% |
Hydrochloric Acid |
100mM |
|
Tween-80 |
0.062% |
Leupeptin |
10mg/L |
|
Zwittergent™ 3-14 |
0.025% |
Methanol |
10% |
|
螯合剂 |
耐受浓度 |
Phenol Red |
0.5mg/mL |
|
EDTA |
100mM |
PMSF |
1mM |
|
EGTA |
2mM |
Sodium Hydroxide |
100mM |
|
Sodium citrate |
200mM |
Sucrose |
10% |
|
耐受浓度 |
TLCK |
0.1mg/L |
|
|
N-acetylglucosamine in PBS, pH 7.2 |
100mM |
TPCK |
0.1mg/L |
|
Ascorbic acid |
50mM |
Urea |
3M |
|
Cysteine |
10mM |
o-Vanadate (sodium salt), in PBS, pH 7.2 |
1mM |
|
Dithioerythritol (DTE) |
1mM |
