小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)是一种通过体外诱导分化获得的原代巨噬细胞模型。它是从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，在特定细胞因子的诱导下，经过约7天的培养，使骨髓中的造血祖细胞增殖、分化为成熟的、具有功能的巨噬细胞。由于其易于获取、可大量扩增、遗传背景一致（可使用基因修饰小鼠）以及能模拟体内巨噬细胞的关键特性，BMDM已成为免疫学、炎症性疾病、感染免疫和肿瘤学等领域中最重要、最常用的原代细胞模型之一。

本试剂盒用于将小鼠骨髓细胞系分化为巨噬细胞。本试剂盒包含重组小鼠M-CSF、重组小鼠IL-4、重组小鼠IL-13和重组小鼠IFN-γ 4种试剂。M-CSF，可以驱动骨髓前体细胞向巨噬细胞谱系定向分化、增殖并存活是必需且唯一关键的细胞因子，通常使用10 - 50 ng/mL 的范围。这个浓度足以支持细胞的增殖和分化，而不会过度激活细胞。巨噬细胞被分为两种主要类型：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。LPS/IFN-γ可刺激细胞向M1型巨噬细胞极化。IL-4 与 IL-13协同作用，驱动细胞向M2表型极化。

产品组分

产品包含

以上试剂使用浓度仅供参考，需根据具体实验条件、实验目的和实际诱导效果优化使用浓度。

        复溶

BMDM培养实验步骤

小鼠骨髓细胞提取

01 小鼠(6~8周)颈椎脱臼法处死，将处死的小鼠迅速放入含有75%酒精的小烧杯中浸泡2min。

注：BMDM受污染后，培养时会变得不粘附，因此暴露骨髓前应确保乙醇彻底浸泡小鼠

02 在超净台中，手术取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；

注：BMDM接种培养后汇合度能达到75%，如果细胞较稀少，可能是由于切割股骨和胫骨边缘过多导致收集的骨髓量不足，每次应切割骨边缘0.5毫米，以减少损失。

03 将取好的骨头转移到装有无菌PBS的培养皿中，涮洗一次后转移至另一个装有无菌PBS的培养皿；

04 用剪刀剪去骨的两端，再用注射器抽取PBS，针头分别插入两端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨头完全变白；

注：分离过程应全程在冰上操作，保持低温环境。

05 收集骨髓悬液，用70um筛网过滤去除小碎片和肌肉组织；将滤过液500g，5 min离心，弃去上清；

06 将离心后的沉淀吹散，用ACK缓冲液去除红细胞，200g、5min离心，弃去上清。

07 将细胞以5×10^5个cells/mL接种在含有10%FBS、1%青霉素-链霉素和10ng/mL M-CSF的DMEM培养基中进行培养。

巨噬细胞极化诱导

隔天半量换液，给细胞补充新鲜的含细胞因子M-CSF的培养基。诱导分化6-7天，细胞分化成M0。

注：大概3天后，骨髓细胞培养物开始呈现良好状态，形成了分裂细胞簇，此时已经可以观察到最初的贴壁细胞

M1方向极化

分化6-7天后，在Mouse M-CSF存在的情况下，继续加入100ng/ml的LPS和50ng/ml的Mouse IFN-γ，极化24-48小时；

M2方向极化

分化6-7天后，在Mouse M-CSF存在的情况下，继续加入40ng/ml的Mouse IL-4和（或）40ng/ml的Mouse IL-13，极化24-48小时。

巨噬细胞鉴定

M0型：流式检测，选择F4/80+和CD11b+双阳表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白；

M1型：流式检测，M1巨噬细胞上调表达CD86、MHCⅡ、CD11c等；

M2型：流式检测，M2巨噬细胞上调表达CD20等。

高活性、高纯度、低内毒素、高批间一致性

                        数据来源于温州医科大学附属第二医院