在众多SNP分型技术中，KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR）凭借其高准确度、低检测成本（仅为TaqMan探针法的40%~60%）、高通量的特点，已成为国内外应用最为广泛的SNP分型技术之一。

KASP是一种基于荧光信号的均相（homogeneous）、终点法（end-point）基因分型技术，其理论基础是等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR）与荧光共振能量转移（FRET）信号系统的巧妙结合。由英国KBioscience公司首创，后被LGC收购并全球推广。

KASP法在整个过程中采用降落PCR的程序，从而保证探针和引物按照预期进行结合，当退火温度高时，引物因为Tm值高，会先与模板进行特异性的结合，然后在Taq酶作用下进行扩增，使得探针扩增的原始模板得到富集，随着退火温度降低，探针开始结合模板，然后产生荧光信号，最终在低于40度情况下通过读取终点的荧光信号来进行SNP分型，保证了该方法很高的分型准确性。其次，与传统TaqMan探针法中每个SNP位点需要合成特异性荧光探针不同，该方法针对上游引物标签序列合成通用探针，可以与各种不同的基因特异引物配合使用，而不需要针对每个特定的位点进行探针合成，这极大降低了实验的试剂成本。此外，KASP在实验操作上满足低、中、高通量基因分型的要求，相比于其他技术，具有一定的灵活性，更容易实现高通量和自动化检测。

KASP的原理可以用"三步走"来理解，简单却精妙：

第一步：引物探针设计。首先，针对SNP的等位基因设计两条对应的上游引物，引物3’末端分别位于各自的SNP位点上，同时引物5’端各自带有一段独特的标签序列，而下游引物则是一条常规设计共用的引物。引物一共是三条，两条带有标签序列的分型上游及一条通用下游。其次，设计两条与上游引物标签序列一致的荧光探针，探针的5’端分别标记不同的荧光基团，同时对应于荧光探针设计各自互补配对的淬灭探针，并在淬灭探针的3’端标记淬灭基团，探针一共是四条，两条荧光探针和两条淬灭探针。

第二步：普通PCR扩增。在第1轮PCR扩增中，等位基因特异引物（3'末端能配对的）就可识别特定等位基因模板，完成等位基因识别，反向通用引物也会结合并完成整个PCR过程，在此阶段，荧光探针仍与其互补的淬灭探针结合，不会产生荧光信号。从第2轮PCR扩增开始，产物中出现含有通用标签序列（tag sequence）的模板，这步之后即可把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物中。随后荧光探针与tag互补的DNA链结合而添加到PCR产物中，因此不再与其互补的淬灭探针结合，从而产生荧光信号而被检测到。

第三步：荧光检测和分析。利用荧光信号检测仪或荧光定量PCR仪（配有相应荧光探针的检测通道）进行信号读取，并用软件采集信号判别等位基因类型（如果进行聚类分析，要用到KlusterCaller或SNPviewer软件）。

▍ 农业分子育种（Molecular Breeding）

KASP技术在农业领域应用最为广泛。在作物（小麦、水稻、玉米、大豆、蔬菜等）和家畜（猪、牛、鸡等）的分子标记辅助选择（Marker-Assisted Selection, MAS）育种中，KASP可对与目标性状（抗病性、抗逆性、产量、品质等）紧密连锁的SNP标记进行高通量分型，实现苗期的早代筛选。相较于传统基于表型的田间筛选，MAS结合KASP技术可将育种周期缩短30%~50%，大幅降低田间试验面积和人力成本。此外，KASP还广泛用于品种纯度鉴定、种质资源遗传背景分析和杂交种亲本真实性验证。对于多倍体和复杂基因组作物（如小麦为异源六倍体），KASP表现出优异的位点转化率和分型清晰度。

▍ 种质资源鉴定与指纹图谱构建

用一组高多态性KASP标记即可对数百份种质进行遗传多样性分析和DNA指纹图谱构建，助力品种权保护、种子纯度和真实性鉴定。小麦、水稻、玉米、辣椒、甜瓜等多种作物均已建成KASP标记库。

▍ 遗传图谱构建与QTL定位

KASP标记密度高、分型准确，是构建高密度遗传连锁图谱和精细定位QTL的理想工具，适合F₂、RIL、DH等各类遗传群体。

▍ 医学遗传学研究

在医学领域，KASP用于疾病相关SNP位点的关联分析、药物基因组学（pharmacogenomics）研究和遗传病风险评估。例如，通过检测特定药物代谢酶基因（如CYP450家族）的SNP位点，可实现个体化用药指导。在肿瘤研究领域，KASP可用于体细胞突变的快速筛查和验证。此外，KASP在新生儿遗传代谢病筛查、人群遗传多样性研究以及法医学个体识别中也有重要应用。

▍ 转基因事件检测与食品安全

KASP技术可用于食品的品种鉴定和掺假检测，如鉴别特定品种的大米、橄榄油产地溯源、肉类品种鉴定等，可快速、准确地检测转基因品系特异性位点，适用于农业监管和食品真伪鉴别。

使用翌圣KASP试剂16976和市面上同类产品，搭配多组引物，同时检测100copies/μL野生型模板（WT模板）、100copies/μL突变型模板（Mut模板）和混合型模板，结果显示两者扩增曲线峰形、Ct值、分型能力无显著差异。