导读

土壤与水生态系统中的微生物群落，是驱动元素循环、维持环境健康的核心引擎。然而，超过99%的环境微生物无法通过传统培养方法获得。以16S rRNA基因为靶标的高通量测序技术，突破了培养局限，实现了对复杂微生物群落的快速、高分辨率解析。本文将从技术原理、应用场景、实验流程及配套方案四个维度，系统梳理16S测序在环境微生物研究中的落地路径。

图1海洋和陆地生物中的微生物与气候变化（图片来源：网，侵删）

一、背景：从“黑箱”到“图谱”的技术跨越

土壤和水体是地球上微生物多样性最丰富的生境。长期以来，环境微生物研究依赖于平板培养、磷脂脂肪酸分析或末端限制性片段长度多态性等方法。此类方法存在通量低、分辨率有限，大量功能微生物被遗漏的弊端。

16S rRNA基因存在于所有原核生物中，由保守区和可变区交替排列。保守区可用于通用引物设计，可变区则携带物种特异的进化信息。随着高通量测序成本下降与扩增子建库技术的成熟，研究者可通过一次实验获得成百上千个样本的微生物群落指纹，系统揭示环境扰动下的菌群响应规律。

当前，16S扩增子测序已从单纯的物种组成描述，拓展至群落功能预测、共发生网络构建及标志物筛选等深层分析，成为环境微生物组研究的入门级标配工具。

二、技术应用：覆盖从基础调查到机制解析的全场景

1. 土壤微生物多样性基线调查

不同土地利用方式（耕地、林地、湿地）、施肥制度（有机肥/化肥）及污染胁迫（重金属、农药残留）均会重塑土壤菌群结构。16S测序可定量评估α多样性（群落丰富度）与β多样性（群落差异），识别优势菌门/菌属的消长规律，为土壤健康评价提供微生物指标。

2. 水体污染指示与生态修复监测

饮用水源、河流、湖泊及沉积物中的微生物群落对外源污染物高度敏感。通过对比清洁区与污染区的菌群差异，可筛选潜在的污染指示类群（如某些变形菌纲与污染物浓度呈正相关）。在人工湿地、生物炭修复等工程中，16S测序用于追踪功能菌（如脱氮菌、降解菌）的定植效率。

3. 极端生境微生物资源挖掘

盐碱地、酸性矿排水、深海热液、冰川融水等极端环境孕育着独特的生命适应策略。全长16S测序结合分离培养，可实现新物种/新类群的快速鉴定，拓展微生物资源库。

4. 微生物生态网络与功能预测

基于16S扩增子数据构建共现网络，推断菌群间的互作关系（共生、竞争、拮抗）。结合PICRUSt2、FAPROTAX等工具，可从16S数据中预测群落的功能基因丰度，间接评估碳氮硫循环、致病基因、抗生素抗性基因的潜在风险。

图2  农业以及其他人类活动影响微生物（图片来源：网，侵删）

三、常见实验步骤：

1. 样本采集与保存

土壤：去除表层凋落物，采集0–20 cm根际或非根际土壤，过2 mm筛去除杂质，液氮速冻后转-80℃保存。

水体：根据浊度选择过滤体积（清洁水>2 L，浊水0.5–1 L），采用0.22 μm滤膜富集微生物，滤膜折叠后置入无菌冻存管，干冰运输。

2. 核酸提取

环境样本富含腐殖酸、金属离子及多糖，是PCR抑制的主要来源。推荐采用机械裂解与化学裂解相结合的提取方案，配套专用磁珠或离心柱纯化，去除抑制剂的同时兼顾革兰氏阳性菌的破壁效率。

3. 目标区域扩增与文库构建

引物选择：二代测序常用V3-V4区或V4区，三代测序推荐全长引物以获得种水平分辨率。

建库策略：采用两步扩增法，在PCR扩增的同时引入测序接头与样本标签（Barcode/Index），显著缩短建库周期。扩增循环数需根据样本起始量优化，低生物量样本建议增加循环数但需控制非特异扩增。

图3  细菌16S rRNA基因序列组成及引物选择（图片来源：网，侵删）

4. 高通量测序

Illumina/MGI平台：PE250或PE300模式，适合V3-V4、V4等短片段。

PacBio/ONT平台：适合全长16S测序，读长>1400 bp，直接获取完整可变区信息。

5. 生物信息分析

原始数据→质控过滤→去噪/ASV聚类→物种注释→多样性分析→差异物种筛选→功能预测。常用分析软件包括QIIME2、DADA2、R（vegan、ggplot2）等。

四、总结：从“看清”到“看懂”的技术进阶

16S测序已在环境科学领域完成从“前沿工具”到“常规手段”的转变。其核心价值在于将不可培养的微生物世界转化为可量化、可比较、可关联的数值矩阵。当前技术发展呈现三大趋势：

分辨率升级：从短读长V区到全长16S，鉴定精度从“属”迈向“种”；

活性导向：DNA水平反映“存在”，RNA水平（16S转录本）反映“活性”，结合两者可定位真实参与功能的微生物；

多组学融合：16S与宏基因组、宏转录组等数据整合，驱动从“相关性”走向“因果性”推断。

对于环境研究者而言，掌握16S测序技术不仅是工具更新，更是研究范式的跃迁。

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