在生命科学中，过去人们认为基因组的核苷酸序列决定生物遗传特征，而表观遗传学发现，核苷酸序列不变时生物表型也能稳定遗传，这一机制影响着发育、疾病等关键生命过程。DNA 甲基化是研究最深入的表观遗传修饰，指在特定酶催化下，以 S - 腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到 DNA 特定碱基上的过程，它能调控基因 “开启” 或 “关闭”，对生理过程很重要，因此精准检测 DNA 甲基化状态，对探索生命机制、解析疾病机理、寻找诊断标志物等都有关键意义，是推动相关领域发展的重要支撑。

图1. 胞嘧啶甲基化的过程

在DNA 甲基化修饰中，以下三种甲基化模式最为常见：

 

• Dam甲基化：在GATC序列中腺嘌呤N6位发生甲基化。

• Dcm甲基化：在CCAGG和CCTGG序列中第2个胞嘧啶C5位发生甲基化。

• CpG甲基化：CpG甲基转移酶将甲基转移到C残基的C5位置。（真核生物DNA的CpG甲基化是分布最为广泛的一类甲基化修饰模式）。

图2. Dam、Dcm、CpG甲基化示意图

 

甲基化敏感内切酶：检测 DNA 甲基化的关键工具

在明确 DNA 甲基化检测对生命科学与医学研究的关键价值后，如何高效、精准地实现对 DNA 甲基化状态的分析便成为核心需求，而甲基化敏感限制性内切酶正是满足这一需求的重要工具。这类酶具有特殊的识别特性，它们能精准识别 DNA 链上特定的碱基序列，却会因这些序列中碱基是否发生甲基化而表现出不同的切割活性。

对于甲基化敏感的内切酶而言，当甲基化位点与限制性内切酶识别序列发生重叠，酶切会受到阻断或影响，可分为两种情况：

甲基化敏感的内切酶能够直接区分 DNA 片段的甲基化状态，为后续通过凝胶电泳、PCR 扩增等技术分析特定基因区域的甲基化水平奠定了基础。

目前，利用甲基化敏感内切酶对基因组 DNA 序列进行识别与切割，是研究单个位点甲基化水平的常用策略。基于这一策略发展出的技术包括：甲基敏感的限制性内切酶 PCR、甲基敏感的限制性内切酶 qPCR、简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）、甲基化敏感性的限制酶测序（MRE-Seq）。下文将深入解析这些技术的原理及优势，为科研选择提供参考。

甲基敏感的限制性内切酶 PCR（Methyl-Sensitive Restriction Enzymes PCR）是发展较早的甲基化检测技术，其原理清晰易懂：

• 若 DNA 位点为低甲基化状态，对应的酶切位点可被甲基敏感限制性内切酶切开，经过 PCR 扩增后，与对照组相比，扩增产物的条带会消失或亮度显著变暗；

• 若 DNA 位点为高甲基化状态，对应的酶切位点无法被酶切开，经过 PCR 扩增后，与对照组相比，扩增产物的条带亮度基本一致。

基于这一原理，科研人员可通过凝胶电泳的结果，快速判断目标位点的甲基化水平高低。该技术具有操作简单、实验成本低、结果直观易观察的优势，在早期甲基化研究中应用广泛。

图3. 甲基敏感的限制性内切酶PCR流程^[1]

在甲基敏感的限制性内切酶 PCR方法的基础上发展出更精确的甲基化定量分析，即使用荧光定量PCR（qPCR）对酶切后的底物进行检测。其原理：

因此，位点甲基化程度越高，可供PCR扩增的DNA模板就越多，在qPCR中就越早检测到DNA扩增（即Ct值越低）。通过 Ct 值的差异，可实现对甲基化水平的精准定量，为甲基化研究提供更精确的数据支持。

图4. 限制酶消化的特定甲基化位点分析^[1]

简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）的核心原理是通过 “亚硫酸盐处理 + 靶向测序” 实现甲基化位点的高效检测。首先用限制性内切酶切割基因组 DNA，富集含 CpG 位点的特定片段并构建文库；随后用亚硫酸盐处理这些 DNA 片段，使未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变；最后通过高通量测序获取序列信息，将测序结果与参考基因组对比，若原 C 位点测序结果为 C，则说明该位点发生甲基化，若为 T（U 在 PCR 扩增中转化为 T），则为未甲基化，从而精准定位并量化基因组中特定区域的甲基化状态。

由于RRBS通过特异性限制性内切酶对基因组中CpG富集区域进行分析，大大减少了所需测序数据量，仅需10–300 ng样本量即可有效和准确分析，具有时间和成本效益，该技术对 DNA 样本的 input 质量要求较低，适用范围更广。

图5.RRBS原理概述^[2]

MRE-seq 的实验流程如下：首先利用多种甲基化敏感限制性内切酶（如 HpaII 等）对基因组 DNA 进行扫描，这类酶仅能特异性切割未发生甲基化的 CpG 位点；随后将酶切产物合并，通过分选获得目标片段，依次进行末端修复反应与单核苷酸接头连接，经 PCR 扩增及产物纯化后，即可上机开展测序（图 6）。将测序结果与参考基因组进行比对后，可通过分析未被切割的 CpG 位点信息，进一步转化得到基因组特定位点的甲基化水平。

作为一种具备单CpG 分辨率的 DNA 甲基化分析技术，MRE-Seq 尤其适合低 CpG 密度区域的甲基化检测。但该技术也存在一定局限性：一方面，其检测范围依赖于特定限制酶的识别序列，基因组中酶切位点的分布直接决定了检测覆盖范围，存在覆盖盲区；另一方面，实验过程中可能出现的不完全酶切现象，可能导致部分假阳性结果，对实验准确性造成影响。

图6. MRE-Seq原理概述^[2]

除上述四种核心技术外，基于 “甲基化敏感酶识别切割基因组 DNA 序列” 原理发展的甲基化检测方法还有很多，例如差异甲基化杂交技术（DMH）、荧光甲基化检测技术（LUMA）、连接介导 PCR 富集 HpaII 微小片段技术（HELP）等。这些技术各有特点，在甲基化分析与检测领域中发挥着重要作用，为科研人员提供了多样化的工具选择，助力深入探索 DNA 甲基化模式。

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参考文献：

[1] Khulan B, Thompson RF, Ye K, Fazzari MJ, Suzuki M, Stasiek E, Figueroa ME, Glass JL, Chen Q, Montagna C, Hatchwell E, Selzer RR, Richmond TA, Green RD, Melnick A, Greally JM. Comparative isoschizomer profiling of cytosine methylation: the HELP assay. Genome Res. 2006 Aug;16(8):1046-55. 

[2] Li S, Tollefsbol TO. DNA methylation methods: Global DNA methylation and methylomic analyses. Methods. 2021 Mar;187:28-43.