翌圣GMP级别IIs型内切酶——mRNA药物疫苗研发生产首选

IIs型限制性内切酶：mRNA药物生产与Golden Gate组装的技术核心

限制性内切酶被称为DNA研究中的“手术刀”，自发现以来推动了许多基础生物学研究和商业化应用的发展。在往期的文章中已经对限制性内切酶做了详细介绍：干货|限制性内切酶知多少？今天为大家介绍IIs型内切酶。

特殊的IIs型内切酶

II型限制性内切酶是目前基因工程中最常见的切割酶，特异性识别4-8个核苷酸序列（具有回文结构），切割位点位于识别位点内或附近，酶切后生成粘性末端或者平末端。II型内切酶可细分为11个类型：A, B, C, E, F, G, H, M, P, S和T。

IIs型内切酶属于II型内切酶中较为特殊的一类，突出特点在于：

1. 识别位点为不对称序列，在识别位点下游切割DNA。

2. 酶切位点与识别位点之间的距离是酶依赖的，酶与识别位点结合后，即可切割适当距离DNA序列。

3. 对切割位点序列无要求，可以是任意序列。

4. 特定IIs型内切酶切割两个不同DNA片段所形成的的黏性末端不配对。

图1. Type II与Type IIs型内切酶识别位点与切割序列比较

IIs型内切酶基于以上特性，成为了mRNA生产中质粒线性化的首选酶，同时也开创了Golden Gate组装技术。

IIs型内切酶用于质粒线性化

mRNA药物生产过程中，常使用质粒作为体外转录步骤中的DNA模板，由于环状质粒作为转录模板会产生长度不同的RNA产物，所以环状质粒需要酶切线性化，转录形成特定长度的RNA产物。

图2. mRNA疫苗的示意图及其抗原表达的机制^[^1]

IIs型内切酶的切割位点位于识别位点之外，线性化后的DNA模板上不会留下“疤痕”，体外转录过程中也不会添加不需要的核苷酸。poly（A）尾巴（具有调节mRNA翻译效率功能）可以通过质粒DNA模板限制切割和转录获得，在mRNA产品中加入特定数目的poly（A）。因此IIs型内切酶成为mRNA体外合成中质粒线性化的首选酶。

IIs型内切酶用于Golden Gate组装

IIs型内切酶识别位点是一个非回文对称的序列，切割位点位于识别位点的外侧，因此，当被IIs型内切酶酶切后的两个片段相连时，原来的识别位点不存在，在后续的酶切连接反应中不会被再次切割。Golden Gate组装就是利用IIs型内切酶的这一特性在这些酶的识别序列外侧人为地设计切割位点不同的序列，然后利用同一内切酶产生不同的黏性末端，从而实现酶切与连接在同一管内，一次性无缝组装多个片段。

图3. Golden Gate assembly流程图^[^2]

Golden Gate assembly技术流程：

1. 通过PCR扩增或寡核苷酸合成等技术向目的片段中引入IIs型内切酶（如BsaI、BsmBI等）的识别序列。

2. IIs内切酶识别目的片段和载体上的酶切位点，并在识别位点之外进行酶切。

3. 在连接酶的作用下将目的片段和载体进行无缝连接，实现单片段或多片段重组。

作为中国分子酶领域的领军企业，翌圣生物成功攻克了限制性内切酶研发的 “卡脖子” 难题。针对mRNA研究和Golden Gate组装，我们整理了以下常见IIs限制性内切酶选择指南，帮助科研人员无缝替换进口酶 —— 无需改变现有实验流程，即可获得一致甚至更优的酶切效果。

常用IIs型限制性内切酶选择指南

产品定位	产品名称	产品货号	酶切位点	甲基化影响
GMP级别IIs型	BspQI GMP-grade	10664ES	5'-GCTCTTC(N)↓-3' 3'-CGAGAAG(N)4↑-5'	无影响
5-15min快速酶切系列	FuniCut® BbsI	15070ES	5'-GAAGAC(N)₂↓-3' 3'-CTTCTG(N)₆↑	无影响
	FuniCut® BsaI	15005ES	5'-GGTCTC(N)1↓-3' 3'-CCAGAG(N)5↑-5'	Dcm；CpG
	FuniCut® Esp3I (BsmBI)	15048ES	5'-CGTCTC(N)1↓-3' 3'-GCAGAG(N)5↑-5'	CpG；EcoBI
	FuniCut® BsmI	15090ES	5'-GAATGCN↓-3' 3'-CTTAC↑GN-5'	EcoBI
	FuniCut® EarI	15066ES	5'-CTCTTC(N)₁↓-3' 3'- GAGAAG(N)₄↑-5'	CpG
	FuniCut® FokI	15083ES	5'-GGATG(N)9↓-3' 3'-CCTAC(N)13↓-5'	Dcm；CpG；EcoBI
	FuniCut® MnlI	15051ES	5'-CCTCN7↓-3' 3'-GGAGN6↑-5'	EcoBI
常规系列IIs型	BsrDI	15214ES	5'-GCAATGNN↓-3' 3'-CGTTAC↑NN-5'	EcoBI

除以上常用限制性内切酶产品，翌圣现有超100种限制性内切酶，满足超90%常用需求。戳常用限制性内切酶选择指南（含酶切位点、同裂酶、甲基化）或扫描下方二维码，文件包含：货号、产品名称、酶活、切割位点、buffer兼容活性等信息。

参考文献

[1] Maruggi G, Zhang C, Li J, Ulmer JB, Yu D. mRNA as a Transformative Technology for Vaccine Development to Control Infectious Diseases. Mol Ther. 2019;27(4):757-772.

[2] Biró J B, Kecskés K, Szegletes Z, et al. Golden EGG, a simplified Golden Gate cloning system to assemble multiple fragments[J]. Scientific Reports, 2024, 14(1): 25288.

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